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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2012.tde-11012013-110805
Documento
Autor
Nombre completo
Carolina Petri Bernardes
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2012
Director
Tribunal
Vilela, Suely (Presidente)
Beleboni, Renê de Oliveira
Rodrigues, Renata Santos
Crott, Luciana Simon Pereira
Marcussi, Silvana
Título en portugués
Estudos bioquímicos e estruturais de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops pirajai
Palabras clave en portugués
Bothrops piraja
Enzimas proteolíticas
Hemorragia
Hemostasia. Inf
Membrana basal
Metaloprotease
Resumen en portugués
As peçonhas de serpentes são misturas complexas de moléculas bioativas resultando em um produto biológico eficiente que tem como principais objetivos a promoção de imobilização, morte e digestão inicial de presas. As metaloproteases e as serinoproteases estão entre as principais enzimas responsáveis por afetar o sistema hemostático por diferentes mecanismos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de uma metaloprotease da classe P-I a partir da peçonha de Bothrops pirajai. A metaloprotease foi isolada utilizando três passos cromatográficos: exclusão molecular em Sephacryl S-200, troca iônica em CMSepharose e afinidade em Blue Sepharose, resultando na metaloprotease denominada BpirMP. A massa molecular da enzima foi determinada por espectrometria de massas (23,15 kDa), e conforme visualizado por SDS-PAGE, a molécula apresentou cadeia polipeptídica única. A determinação da sequência parcial de aminoácidos e o alinhamento múltiplo com sequências depositadas em bancos de dados mostrou alta identidade (70-90%) com outras metaloproteases da classe P-I de peçonhas de serpentes. A molécula possui a sequência de consenso HELGHNLGMEH, bem como a sequência de CVM, que caracterizam a superfamília das metaloproteases "metzincinas". A enzima mostrou ação sobre o fibrinogênio, degradando as cadeias Aα e Bβ, sendo capaz também de degradar coágulos de fibrina e de sangue in vitro, dissolvendo completamente o coágulo de sangue na maior dose testada. A enzima não apresentou atividade coagulante sobre plasma sanguíneo. A atividade proteolítica da metaloprotease sobre a azocaseína foi avaliada em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando que a enzima tem a sua atividade reduzida em pHs ácidos e em temperaturas superiores a 60 ºC. A atividade proteolítica foi inibida por agentes quelantes como EDTA, EGTA e 1,10- fenantrolina e por agentes redutores como β-mercaptoetanol e DTT. Inibidores específicos de serinoproteases (benzamidina, leupeptina e aprotinina) não apresentaram efeito sobre a atividade proteolítica da BpirMP. A enzima mostrou-se hemorrágica, apresentando dose hemorrágica mínima (DHM) de 50 µg. BpirMP hidrolisou componentes da membrana basal tanto in vitro como in vivo, degradando preferencialmente laminina e nidogênio. A metaloprotease apresentou efeitos sobre processos inflamatórios como a indução de edema e dor, promovendo um pronunciado recrutamento de neutrófilos e aumento significativo na quantidade total de leucócitos no exsudato inflamatório. A avaliação da participação de diferentes mediadores inflamatórios na indução do edema e hiperalgesia indicaram o envolvimento de metabólitos do ácido araquidônico e histamina. O efeito citotóxico induzido pela metaloprotease foi avaliado sobre o músculo gastrocnêmico de camundongos e também nos tecidos cardíaco, renal, pulmonar e esplênico, apresentando degeneração das fibras musculares e infiltrado leucocitário. Os resultados demonstram que a BpirMP é uma metaloprotease de baixa massa molecular, com baixa atividade hemorrágica, pertencente à classe P-I, descrita pela primeira vez para a espécie B. pirajai. A caracterização da peçonha de Bothrops pirajai foi realizada por meio de técnicas proteômicas para determinar a sua composição proteica. As proteínas foram separadas por RP-HPLC, seguido por SDS-PAGE, digestão tríptica "in-gel" e identificação por espectrometria de massa por MALDI-TOF/TOF, e atribuição de famílias de proteínas conhecidas por homologia. Proteínas pertencentes a sete famílias foram encontradas na peçonha de B. pirajai, incluindo grande abundância de fosfolipases A2 (~40%) e metaloproteases (~20%).
Título en inglés
Structural and biochemical studies on a metalloproteinase isolated from Bothrops pirajai snake venom
Palabras clave en inglés
Basement membrane
Bothrops pirajai
Hemorrhage
Hemostasis
Metalloproteinase
Proteolytic enzymes
Resumen en inglés
Snake venoms are complex mixtures of bioactive molecules resulting in an efficient biological product with the purpose of promoting immobilization, death and initial digestion of prey. Metalloproteinases and serine proteases are among the major enzymes responsible for affecting the hemostatic system by different mechanisms. The present study aimed at the isolation and biochemical and structural characterization of a P-I class metalloproteinase from Bothrops pirajai snake venom. This enzyme was isolated using three chromatographic steps: molecular exclusion on Sephacryl S-200, ion exchange on CM-Sepharose and affinity on Blue Sepharose, resulting in a metalloproteinase called BpirMP. Its molecular mass was determined by mass spectrometry (23.15 kDa), and as visualized by SDS-PAGE, the molecule showed a single polypeptide chain. The determination of the partial amino acid sequence and multiple alignment with sequences deposited in databases showed high identity (~90%) with other P-I class metalloproteinases from snake venoms. BpirMP has the consensus sequence HELGHNLGMEH and the VCM sequence, which characterize the superfamily of metzincins metalloproteinases. The enzyme showed activity on fibrinogen, degrading Aα and Bβ chains, and was also able to degrade fibrin and blood clots in vitro, completely dissolving the blood clot at the highest dose tested. The enzyme was unable to coagulate blood plasma. The proteolytic activity of the metalloproteinase on azocasein was evaluated under different conditions of pH and temperature, showing that BpirMP has its activity reduced in acidic pHs and temperatures above 60 ºC. The proteolytic activity was inhibited by chelating agents such as EDTA, EGTA, and 1,10- phenanthroline and by reducing agents as β-mercaptoethanol and DTT. Specific inhibitors of serine proteases (benzamidine, leupeptin and aprotinin) had no effect on the proteolytic activity of BpirMP. The enzyme induced hemorrhage, presenting a minimal hemorrhagic dose (MHD) of 50 µg. BpirMP hydrolyzed basement membrane components both in vitro and in vivo, preferably degrading laminin and nidogen. The metalloproteinase showed effects on inflammatory processes such as induction of pain and edema, promoting a pronounced neutrophil recruitment and significant increase in the total number of leukocytes in inflammatory exudate. The evaluation of the contribution of different inflammatory mediators in the induced edema and hyperalgesia indicated the involvement of arachidonic acid metabolites and histamine. The cytotoxic effect induced by BpirMP was evaluated on the gastrocnemius muscle of mice and heart, kidney, lung and spleen tissues, showing degeneration of muscle fibers and leukocyte infiltration. The results demonstrate that BpirMP is a low molecular mass and low hemorrhagic metalloproteinase belonging to the P-I class, described for the B. pirajai species for the first time. The characterization of Bothrops pirajai venom was performed using proteomic techniques to determine its composition. Proteins were separated by RP-HPLC, followed by SDSPAGE, tryptic in-gel digestion and identification by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, assigning family classification by homology to known proteins. Seven protein families were found in the venom of B. pirajai, with an abundance of phospholipases A2 (~40%) and metalloproteinases (~20%).
 
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Tese_Completa.pdf (4.28 Mbytes)
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Fecha de Liberación
2015-01-11
Fecha de Publicación
2021-04-09
 
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