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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2018.tde-05102016-152217
Document
Author
Full name
Priscila Yumi Tanaka Shibao
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2016
Supervisor
Committee
Braga, Eliane Candiani Arantes (President)
Beleboni, Renê de Oliveira
Silva, Flávio Henrique da
Title in Portuguese
Transcriptoma da glândula mucosa de Rhinella schneideri
Keywords in Portuguese
NGS
Rhinella schneideri
Transcriptoma
Veneno
Abstract in Portuguese
Bibliotecas de produtos naturais são fontes de moléculas com ações farmacológicas, com diversas aplicações biotecnológicas. Estes compostos apresentam alta especificidade para o alvo, resultante de longo processo de seleção natural, sendo interessantes como ferramentas de estudo e princípios ativos. Porém, apesar da riqueza de estruturas presentes em tais secreções, as dificuldades em obter moléculas puras em grandes quantidades, o alto custo e o tempo de purificação, tornam-se barreiras para seu uso. Assim, cada vez mais, as técnicas ômicas são usadas como uma alternativa para produção destas toxinas obtidas em maior escala. A transcriptômica, técnica que consiste na produção de biblioteca de cDNA a partir do RNA obtido da de organismo, tecido ou célula de interesse, é altamente relevante, já que identifica o material proteico que é realmente transcrito a partir do RNA obtido em determinado tempo e situação. Sapos ainda são animais pouco estudados, quando comparados a outros animais peçonhentos e venenosos, e um dos fatores responsáveis por isso é o baixo rendimento na purificação de toxinas de seu veneno. A fim de se identificar componentes presentes nas secreções do sapo R. schneideri, foi, primeiramente, realizada extração de RNA poli A+ das secreções recém obtidas das glândulas mucosas e das secreções armazenadas por 2 anos no laboratório. A secreção armazenada há dois anos revelou qualidade e quantidade mais apropriadas para o estudo e foi, portanto, usada como material de partida para a construção do transcriptoma por metodologia tradicional. Este transcriptoma resultou em 6 clones com boa qualidade, sendo que um deles, Rs02, apresentou similaridade com a região do pró peptídeo da odorranaina. Uma vez que este transcriptoma não revelou resultados satisfatórios devido à sua baixa eficiência e visando maximizar o conhecimento sobre a secreção, um novo transcriptoma foi construído usando sequenciamento de nova geração, com sequenciador Illumina e RNA total extraído do tegumento contendo glândulas mucosas de um espécime como material de partida. O novo transcriptoma resultou em aproximadamente 131 milhões de reads brutos. Os reads foram filtrados de modo que apenas aqueles com boa qualidade (Q>20) fossem submetidos à montagem de novo. Esta etapa resultou em aproximadamente 130 milhões de reads, com média de 68 pb. Os reads foram então agrupados em contigs usando o programa SOAPdenovo2-Trans e submetidos a diversas abordagens de anotação funcional. Foram encontrados cDNAs codificantes de diversos peptídeos e proteínas com potencial aplicação biotecnológica. Além da abordagem ômica, ensaios de caracterização bioquímica, como atividade enzimática, cromatografia e eletroforese, auxiliaram a detecção de protease sem relatos prévios em secreções de sapo, uma fosfolipase A2, bem como lectina e galectina. Adicionalmente, através do transcriptoma foram identificadas cobatoxinas, mucinas e ficolinas. Portanto, este trabalho foi pioneiro no entendimento molecular do veneno da glândula mucosa de R. schneideri por métodos de vanguarda e análises bioquímicas.
Title in English
Rhinella schneideri mucous gland transcriptome
Keywords in English
NGS
Poison
Rhinella schneideri
Transcriptome
Abstract in English
Natural products libraries are known as medicine molecules sources once these molecules have a high target specificity inherited from the long natural evolutionary process. Thereby, animal, plant and microorganisms' secretions are very important to biotechnological applications. However, despite the large number of molecules that can be found in these secretions, the difficulty on obtainment enough purification yield, high cost and long purification time, besides the small secretion amount provided by the studied organism, are factors that make this kind of study even harsher. These are the reasons why omic studies are becoming an alternative to produce these toxins in a larger scale, which allow new researches. Transcriptome is a technique that consists on the production of cDNA libraries from the secretion or gland RNA, using the transcriptase reverse enzyme, which results in a holistic poison understanding. Toads are animals that are still not widely studied, if we compare them with other venomous animals, mainly because of the insufficient purification yield. Thus, the mucous gland transcriptome from Rhinella schneideri poison, a toad that is widely found in Brazilian territory, has a great relevance on the elucidation and possibility to use several kind of molecules, especially because this gland produces unknown molecules. Thereof, aiming to unravel this poison molecules, we first compared the RNA yield from fresh and two years stored mucous gland secretion. The stored secretion has shown more suitable RNA, which was used to construct a Sanger sequencing transcriptome. It resulted in 6 clones and one of them had a good hit with odorranain pro-peptide region. In order to increase the knowledge about the secretion, we turned to Next Generation Sequencing transcriptome using Illumina technologies and one specimen integument as raw material. The new transcriptome resulted in approximately 131 million raw reads. These reads were filtered so that only those with good quality (Q>20) were used to perform the assembling. The latter step resulted in approximately 130 million reads with 68 bp average length. The reads were grouped into contigs using the assembler. Then, the resulting contigs were submitted to different functional annotation approaches. We unraveled cDNAs encoding peptides and protein with biotechnological application. Besides the omic approach, assays for biochemical characterization including chromatography, electrophoresis and proteolytic assays complemented the identification of a protease for the first time in toad secretions, phospholipase A2, as much as lectins and galectins. Thus, the transcriptome also allowed the identification of cobatoxins, mucins and ficolins. Therefore, this is the first work about the molecular composition of Rhinella schneideri mucous gland poison through avant-garde methodology and biochemical anaylsis.
 
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Release Date
2020-05-22
Publishing Date
2018-07-27
 
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