A Doença de Alzheimer (DA) é uma demência neurodegenerativa progressiva que afeta cerca de 50 milhões de pessoas ao redor do mundo. A DA é caracterizada patologicamente pela presença de placas senis e de novelos neuro fibrilares no cérebro, causadas pelo acúmulo extracelular dos peptídeos β-amilóides (Aβ) e da proteína tau, respectivamente. O diagnóstico conclusivo da DA tem sido eminentemente clínico e, nesses casos, a neurodegeneração já se instalou no cérebro do paciente. Portanto, esforços têm sido realizados para encontrar um biomarcador molecular para a identificação de pacientes em risco de desenvolver a DA, bem como para o diagnóstico precoce e acompanhamento da progressão das neurodegenerações. Neste projeto, os métodos empregando as técnicas de microextração em fase sólida no capilar (in-tube Solid Phase Microextraction, in-tube SPME) associada à cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (Ultra High Performance Liquid Chromatography - tandem Mass Spectrometry, UHPLC-MS/MS) e a microextração em ponteiras descartáveis (Disposable Pipette Extraction, DPX) associada à MS/MS foram desenvolvidos e validados para a determinação de peptídeos Aβ em amostras líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com a DA. Durante o desenvolvimento do método in-tube SPME UHPLC-MS/MS, diferentes colunas cromatográficas e composições de fases móveis foram avaliadas. A coluna cromatográfica em fase reversa Acquity UPLC Peptide BEH C18 (150 mm × 2.1 mm e 1,7 µm) com a fase móvel constituída de (A) água + 0,3% hidróxido de amônio e (B) acetonitrila e temperatura de 35°C apresentou picos simétricos e menor tempo de análise. Uma fase monolítica orgânica com grupos sulfônicos foi sintetizada no interior do capilar de sílica fundida (6 cm × 530 µm d.i.) como fase extratora para a técnica intube SPME e caracterizada através das técnicas microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia vibracional da região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). As condições otimizadas para a síntese da fase monolítica foram: 1- propanol (0,65 mL) e água (0,52 mL) como solventes porogênicos; 3-sulfopropil metacrilato de potássio (SPM) como monômero funcional (0,3306 g); etileno glicol dimetacrilato (EDMA) como agente reticulante (0,2 mL); 2,2'-azobisisobutironitrilo (AIBN) como iniciador radicalar (0,016 g); e polimerização por 24 horas à 60°C. As variáveis in-tube SPME (pH e volume de amostra, solvente e volume para a limpeza da fase e solvente e volume para a eluição dos analitos) foram avaliadas e otimizadas. O método in-tube SPME UHPLC-MS/MS apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram do LIQ - 10 ng mL-1 com coeficientes de determinação (R2 ) maiores que 0,99. Os valores de exatidão (EPR) e precisão (CV) variaram de -11,7 a 14,3% e 1,0 a 18,9%, respectivamente. O método in-tube SPME UHPLC-MS/MS foi aplicado na determinação de peptídeos Aβ, em seis amostras de LCR de pacientes com a Doença de Alzheimer. O método DPX MS/MS utilizou ponteiras DPX (1 mL) contendo 60 mg de fase comercial Oasis MCX®, conectadas a uma seringa de polipropileno. A otimização das variáveis DPX (pH da amostra, tempo de equilíbrio de sorção, volume de amostra/número de ciclos e solução de eluição/número de ciclos) favoreceu a sensibilidade e seletividade do método e o emprego de pequenos volumes de amostra biológica e de solventes orgânicos. 5 µL do extrato final evaporado e reconstituído em 50 µL de fase móvel foram injetados no sistema MS/MS com a fase móvel constituída de (A) água contendo 0,3% hidróxido de amônio e (B) acetonitrila, com vazão de 0,05 mL min-1 ; e infusão direta de uma solução de metanol contendo 10% de hidróxido de amônio concentrado para favorecer a detectabilidade. O método DPX MS/MS apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram do LIQ - 1,5 ng mL-1 com coeficientes de determinação (R2) maiores que 0,99. Os valores de exatidão (EPR) e de precisão (CV) variaram de -13,6 a 13,2 e 0,3 a 12,7%, respectivamente. Portanto, segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método DPX MS/MS poderá ser empregado para a determinação de peptídeos Aβ em amostras de LCR de pacientes com DA.

Alzheimer's Disease (AD) is a progressive neurodegenerative dementia that affects about 50 million people around the world. AD is pathologically characterized by the presence of senile plaques and neurofibrillary tangles in the brain, caused by the extracellular accumulation of β-amyloid peptides (Aβ) and tau protein, respectively. The conclusive diagnosis of AD has been eminently clinical and, in these cases, neurodegeneration has already taken root in the patient's brain. Therefore, efforts have been made to find a molecular biomarker for identifying patients at risk of developing AD, as well as for early diagnosis and monitoring of the progression of neurodegenerations. In this project, the methods employing in-tube solid phase microextraction (in-tube SPME) associated with ultra-efficiency liquid chromatography coupled with sequential mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) and Disposable Pipette Extraction (DPX) associated with MS/MS were developed and validated for the determination of Aβ peptides in cerebrospinal fluid (CSF) samples from patients with AD. During the development of the in-tube SPME UHPLC-MS/MS method, different chromatographic columns and mobile phase compositions were evaluated. The Acquity UPLC Peptide BEH C18 reverse phase analytical column (150 mm × 2.1 mm and 1.7 µm) with the mobile phase consisting of (A) water + 0.3% ammonium hydroxide and (B) acetonitrile and temperature of 35 °C presented adequate chromatographic resolution, symmetrical peaks and shorter analysis time. An organic monolithic phase with sulfonic groups was synthesized inside the fused silica capillary (6 cm × 530 µm i.D.) as an extractor phase for the in-tube SPME technique and characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). The optimized conditions for monolithic phase synthesis were: 1-propanol (0.65 mL) and water (0.52 mL) as porogenic solvents; 3-sulfopropyl methacrylate potassium salt (SPM) as functional monomer (0.3306 g); ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as crosslinking agent (0.2 ml); 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) as radical initiator (0.016 g); and polymerization time (24 hours) and temperature (60°C). The in-tube SPME variables (pH and sample volume, wash conditions, and elution conditions) were evaluated and optimized. The in-tube SPME UHPLC-MS/MS method presented adequate linearity with concentrations ranging from LOQ - 10 ng mL-1 with coefficients of determination (R2 ) greater than 0.99. Accuracy (EPR) and precision (CV) values ranged from -11.7 to 14.3% and 1.0 to 18.9%, respectively. The in-tube SPME UHPLC-MS/MS method was applied to determine Aβ peptides in six CSF samples from patients with Alzheimer's disease. The DPX MS/MS method used DPX tips (1 mL) containing 60 mg of Oasis MCX® commercial phase, connected to a polypropylene syringe. The optimization of the DPX variables (sample pH, sorption equilibrium time, sample volume/number of cycles and elution solution/number of cycles) favored the sensitivity and selectivity of the method and the use of small volumes of biological sample and of organic solvents. 5 µL of the final evaporated extract and reconstituted in 50 µL of mobile phase were injected into the MS/MS system with the mobile phase consisting of (A) water containing 0.3% ammonium hydroxide and (B) acetonitrile, with a flow rate of 0. 05 ml min-1 ; and direct infusion of a methanol solution containing 10% concentrated ammonium hydroxide to enhance detectability. The DPX-MS/MS method showed adequate linearity with concentrations ranging from LOQ - 1.5 ng mL-1 with coefficients of determination (R2 ) greater than 0.99. Accuracy (EPR) and precision (CV) values ranged from -13.6 to 13.2 and 0.3 to 12.7%, respectively. Therefore, according to the analytical validation parameters evaluated, the DPX MS/MS method can be used to determine Aβ peptides in CSF samples from patients with AD.