A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19) causado pelo novo coronavírus humano, denominado de coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), originou-se em Wuhan, China, tem representado uma ameaça global à saúde humana, à segurança pública e à economia global. Para a produção de vírions maduros de SARS-CoV-2 durante o ciclo infeccioso, os metabólitos das células hospedeiras são requeridos, assim como o escape da resposta antiviral é necessário. Nesse contexto, a replicação do SARS-CoV-2 depende da formação de vesículas de membrana dupla (DMVs) que tem a sua biogênese facilitada pelas proteínas não estruturais NSP3, 4 e 6 e formadas a partir do retículo endoplasmático. Além disso de modo a se evadir da resposta imune do hospedeiro esse vírus possui estratégias para antagonizar as respostas dos interferons, que é suprimido em grande parte pela proteína ORF9b. Considerando a importância da formação dos DMVs, buscou-se identificar compostos contra NSP4 e potencialmente impedir a formação das vesículas de membrana dupla. Nesse sentido, a proteína NSP4 foi expressa em Rosetta(TM)(DE3)pLysS, purificada por cromatografia de afinidade e imobilizada em partículas magnéticas as quais foram submetidas à técnica de Ligand fishing com 10 potenciais alcalóides extraídos de espécies de Amaryllidacea, bem como o seu extrato bruto, dos quais cinco foram identificados como potenciais compostos contra SARS-CoV-2. São eles: 2-α-7-dimetoxihomolicorina, hemantidina, albomaculina, tazetina e aulicina, os quais apresentaram razão de afinidade de 1,89; 3,15; 2,9, 2,42 e 1,45 respectivamente. Além disso, a fim de se entender o papel das proteínas NSP4 e ORF9b diretamente nas células, avaliou-se os seus efeitos quando expressas em células da linhagem de fibroblastos pulmonares neonatais de camundongos MLG2908. Os resultados relevaram que ambas as proteínas aumentaram os níveis de espécies reativas de oxigênio mitocondrial na ordem de 39% e 23%, respectivamente. Além disso, após 24 e 48 h pós-transfecção com Nsp4, houve uma redução significativa nos níveis de MAVS, atingindo 0,11% e 0,29%, respectivamente. De maneira semelhante, ORF9b também reduziu a expressão MAVS em 0,31±0,02 após 24 h de transfecção. Adicionalmente, a NSP4 resultou em uma diminuição de 9% e 11%, nos níveis de viabilidade celular e de ATP, assim como uma redução em 8% e 11% do potencial de membrana após 24 e 48 horas de transfecção, respectivamente. Observou-se também a ativação da via intrínseca da apoptose pela NSP4, com aumento da ativação da caspase 9 em 0,22% após 24 h de transfecção e a ativação da caspase 3 em de 0,42 e 0,40% após 48 e 72 h de transfecção, respectivamente. A NSP4 também ativou a via de apoptose independente de caspase, indicada pelo aumento de AIF em 0,49% após 72 h de transfecção. Adicionalmente, a NSP4 causou a fragmentação e condensação nuclear após 24, 48 e 72 h de transfecção, com aumento de 6,64%; 4,54% e 7,89 %, respectivamente, indicando morte celular programada. Esses resultados destacam a influência das proteínas NSP4 e ORF9b do SARS-CoV-2 na função celular, com implicações importantes para a compreensão da patogênese viral e o desenvolvimento de possíveis estratégias terapêuticas.

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, caused by the new human coronavirus, called severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which originated in Wuhan, China, has represented a global threat to human health, public safety and the global economy. For the production of mature SARS-CoV-2 virions during the infectious cycle, metabolites from host cells are required, as well as escape from the antiviral response is necessary. In this context, the replication of SARS-CoV-2 depends on the formation of double-membrane vesicles (DMVs) whose biogenesis is facilitated by the non-structural proteins NSP3, 4 and 6 and formed from the endoplasmic reticulum. Furthermore, in order to evade the host's immune response, this virus has strategies to antagonize interferon responses, which are largely suppressed by the ORF9b protein. Considering the importance of the formation of DMVs, we sought to identify compounds against NSP4 and potentially prevent the formation of double-membrane vesicles. In this sense, the NSP4 protein was expressed in Rosetta(TM)(DE3)pLysS, purified by affinity chromatography and immobilized on magnetic particles which were subjected to the Ligand fishing technique with 10 potential alkaloids extracted from one of the species of Amaryllidacea a Hippeastrum aulicum, of which four were identified as potential compounds against SARS-CoV-2. They are: 2-α-7-dimethoxyhomolycorine, hemanthidine, albomaculin, tazetine and aulicine which presented an affinity ratio of 1.89; 3.15; 2.9, 2.42 and 1,45 respectively. Furthermore, in order to understand the role of NSP4 and ORF9b proteins on mitochondrial function and cell viability, their effects were evaluated in cells from the MLG2908 mouse neonatal lung fibroblast line. The results revealed that both proteins increased the levels of mitochondrial reactive oxygen species by 39% and 23%, respectively. Furthermore, after 24 and 48 h post-transfection with Nsp4, there was a significant reduction in MAVS levels, reaching 0.11% and 0.29%, respectively. Similarly, ORF9b also reduced MAVS expression by 0.31±0.02 after 24 h of transfection. Additionally, NSP4 resulted in a 9% and 11% decrease in cell viability and ATP levels, as well as an 8% and 11% reduction in membrane potential after 24 and 48 hours of transfection, respectively. The activation of the intrinsic apoptosis pathway by NSP4 was also observed, with an increase in the activation of caspase 9 by 0.22% after 24 h of transfection and the activation of caspase 3 by 0.42 and 0.40% after 48 and 72 h of transfection, respectively. NSP4 also activated the caspase-independent apoptosis pathway, indicated by the increase in AIF by 0.49% after 72 h of transfection. Additionally, NSP4 caused nuclear fragmentation and condensation after 24, 48 and 72 h of transfection, with an increase of 6.64%; 4.54% and 7.89%, respectively, indicating programmed cell death. These results show that the SARS-CoV-2 proteins NSP4 and ORF9b affect cellular function, which is important for understanding viral pathogenesis and the development of possible therapeutic strategies.