Bone biomineralization is a complex process that involves the deposition of calcium phosphate crystals on collagen fibrils of the extracellular matrix (ECM). Although matrix vesicles (MVs) have been proposed to be responsible for the initial mineral formation, their role and mechanisms are still not fully understood. This thesis aimed to examine the interplay between MVs and forming mineral during bone mineralization at three levels: individual vesicle observation, mineralization at the interface of a membrane-like model, and in vitro mineralization using osteoblasts culture. To investigate the underlying factors that mediate mineralization in vitro, MVs were isolated from embryonic chicken bones, and their contents, as well as their ability to initiate mineral formation, were examined at a single-vesicle level using near-native cryogenic transmission electron microscopy. This approach revealed that MVs preparations contain non-vesicular particles in addition to bilayered vesicles, affecting the outcome of mineralization experiments. Further investigations using comparative purification and mineralization experiments demonstrated that the primary pathway by which MVs trigger mineralization is through their enhanced phosphatase activity, such as alkaline phosphatase, with the direct mineral nucleation from soluble ions being a secondary process driven by their membrane components. To access this secondary effect, surface-induced mineral nucleation was accessed in a biomimetic model using Langmuir monolayers of synthetic (e.g. phosphatidylcholine and phosphatidylserine) as well as native lipids extracted from MVs. Insitu tracking of mineral formation at Langmuir monolayers revealed that phosphatidylserineenriched nanodomains formed at the membrane surface trigger the mineral nucleation by interacting with calcium and phosphate ions. Having established the interplay between MVs and forming mineral both at the single-vesicle level and using a membrane-like model, the role of MVs in controlling ECM mineralization was finally demonstrated in a primary osteoblast culture. Osteoblasts treated with chloroquine, a blocker of autophagy, resulted in defective ECM mineralization. Although mineralization was impaired, as revealed by alizarin red calcium staining, transmission electron microscopy revealed that MVs were still abundantly present throughout the ECM. However, isolation of MVs and characterization of their content demonstrated reduced expression of mineralization-related proteins, with a remarkable decrease in alkaline phosphatase activity. These observations at cell level suggested that ECM mineralization is impaired when MVs are dysfunctional (i.e., reduced phosphatase activity) and that these structures play a predominant role in bone mineralization, being their release controlled in a cell-context-specific manner.In conclusion, the findings presented in this thesis collectively validate the crucial role of MVs in bone mineralization while also providing valuable insights into the complex interplay between vesicles and the mineralization process.

A biomineralização óssea é um processo complexo que envolve a deposição de cristais de fosfato de cálcio em fibrilas de colágeno da matriz extracelular (MEC). Embora tenha sido proposto que as vesículas da matriz (VMs) atuem nesse processo, os mecanismos envolvidos ainda são pouco entendidos. Esta tese buscou examinar a interação entre as VMs e a formação mineral por meio de observações em três níveis: vesículas individuais, em um modelo mimético de membrana, e em cultura in vitro de osteoblastos. Dessa forma, VMs foram isoladas a partir de ossos de galinha embrionários e caracterizadas quanto ao seu conteúdo assim como a capacidade de iniciar a formação mineral. Caracterização por microscopia eletrônica de transmissão criogênica revelou que preparações de MVs são heterogêneas e contêm além de vesículas bilamelares, uma alta quantidade de partículas não-vesiculares, sendo essa heterogeneidade impactante na habilidade de VMs em induzir mineralização. Investigações adicionais por meio de experimentos comparativos de purificação e de mineralização demonstraram que a principal via pela qual as VMs desencadeiam a mineralização é por meio de seu maquinário enzimático, como a fosfatase alcalina, tal que a nucleação direta de mineral a partir de íons solúveis represente um processo secundário. Para acessar esse efeito secundário, a nucleação mineral induzida pela superfície das VMs foi acessada em um modelo biomimético de membrana usando monocamadas de Langmuir de lipídios sintéticos (fosfatidilcolina e fosfatidilserina) assim como lipídios nativos extraídos de VMs. O rastreamento in-situ da formação mineral nesse modelo revelou que nanodomínios enriquecidos em fosfatidilserina formados na superfície da membrana desencadeiam a nucleação mineral ao interagir com íons cálcio e fosfato. Tendo estabelecido a interação entre as VMs e a formação de mineral tanto ao nível de vesículas individuais quanto no modelo biomimético de membrana, o papel das VMs no controle da mineralização da MEC foi finalmente demonstrado a nível celular usando cultura primária de osteoblastos. Osteoblastos tratados com cloroquina, um bloqueador da autofagia, resultou em mineralização deficiente da MEC. Embora a mineralização dos osteoblastos seja reduzida em presença de cloroquina, como revelado pela coloração de cálcio por vermelho de Alizarina, microscopia eletrônica de transmissão revelou que VMs ainda estavam abundantemente presentes na MEC. No entanto, o isolamento de VMs e a caracterização de seu conteúdo revelaram expressão reduzida de proteínas relacionadas à mineralização, com uma diminuição notável na atividade da fosfatase alcalina. Essas observações no nível celular sugerem que a mineralização da MEC é deficiente se as MVs estiverem disfuncionais (ou seja, atividade de fosfatase reduzida), sugerindo que essas estruturas desempenham um papel predominante na mineralização óssea, sendo sua liberação controlada de maneira específica ao contexto celular. Em conclusão, os resultados coletivamente apresentados nesta tese confirmam a importância das MVs para a mineralização óssea, mas também oferecem novas perspectivas sobre a relação intricada entre as vesículas e a formação mineral.