O Brasil possui grande força na agricultura, com a região de Ribeirão Preto sendo tradicional no cultivo de cana de açúcar. A procura por fontes alternativas de energia que sejam mais sustentáveis e renováveis têm encorajado estudos focados na obtenção de biocombustíveis e outros químicos de maior valor agregado derivados da hidrólise da biomassa lignocelulósica. Com este objetivo, enzimas ativas em carboidratos têm atraído atenção por poderem hidrolisar de forma específica e mais sustentável, evitando geração de resíduos químicos e subprodutos indesejados. Porém, a recalcitrância da parede celular vegetal têm sido um obstáculo para a aplicação industrial da hidrólise enzimática e, para superá-lo, é necessário melhor compreensão as estrutura da parede celular da planta, pré-tratamentos eficientes da biomassa e coquetéis enzimáticos otimizados. Neste trabalho, estudamos a hidrólise enzimática de três frações arabinoxilanas extraídas do colmo da variedade de cana de açúcar SP80-3280 por deslignificação com clorito de sódio apenas, ou com tratamento adicional alcalino ou com DMSO. Combinações de enzimas hemicelulolíticas recombinantes incluíram as glicosil hidrolases xilanases GH10 e GH11, arabinofuranosidase GH43 e α-glucuronidase GH67, junto de uma acetil xilano esterase CE4 e uma feruloil esterase CE1. Análises de açúcares redutores do hidrolisado foram correlacionadas com cromatografia líquida de interação hidrofóbica acoplada a espectrometria de massas e ferramentas de análise de metabolômica. Foi observado que os arabinoxilanos extraídos por métodos diferentes têm organização e estrutura diferentes, resultando em alterações nos perfis de digestão enzimática e nos produtos de hidrólise. O arabinoxilano extraído por tratamento alcalino foi o mais acessível à hidrólise completa por este conjunto de enzimas quando comparado com os polissacarídeos mais recalcitrantes dos extraídos com clorito e DMSO. Além disso, ensaios de combinações enzimáticas com as quatro hidrolases e acetil xilano esterase, apesar de não mostrarem sinergia, mostraram cooperatividade entre as enzimas acessórias e as xilanases. Como não houve comprovação da presença de decorações fenólicas nos arabinoxilanos extraídos, foi feita caracterização bioquímica e biofísica da enzima feruloil esterase, que demonstrou atividade ótima a 60°C e pH 6,5 e eficiência catalítica por volta de 390 s -1.mM-1 contra o substrato sintético etil ferulato. A enzima se mostrou estável e ativa também contra oligossacarídeos do arabinoxilano de farelo de trigo ramificados com grupos ferulato, com grande potencial para uso industrial.

Brazil maintains a strong agricultural base, with a long tradition ofsugar cane cultivation in the region of Ribeirão Preto. The search for more sustainable and renewable alternative energy sources have encouraged studies focussed on obtaining biofuels and other valuable chemicals using sugars derived from the hydrolysis of lignocellulosic biomass. With this goal, carbohydrate active enzymes have also attracted attention as a means of sustainable and specific hydrolysis, avoiding chemical waste and unwanted by-products. However, plant cell wall recalcitrance has hindered the industrial application of enzymatic hydrolysis, and overcoming this obstacle requires a better comprehension of the plant cell wall structure, efficient biomass pre-treatments and improved enzyme cocktails. In this work, we have studied the enzymatic hydrolysis of three arabinoxylan fractions from sugar cane variety SP80-3280 extracted from delignified stem either with sodium chlorine only, or after alkaline treatment or after DMSO extraction. Combinations of recombinant hemicellulolytic enzymes used included the glycosyl hydrolases xylanases GH10 and GH11, arabinofuranosidase GH43, and α-glucuronidase GH67 together with acetyl xylan esterase CE4 and feruloil esterase CE1. Hydrolysate analyses of total reducing sugar were correlated with mass spectrometry coupled with hydrophobic interaction liquid chromatography and metabolomics analysis tools. It was observed that the arabinoxylans from the different extraction methods had distinct structures and organization, resulting in altered enzymatic digestion profiles and hydrolysis products. The alkaline-treated arabinoxylan was most accessible to complete hydrolysis by this set of enzymes in comparison to the more recalcitrant polysaccharides in the chlorite and DMSO extracts. Furthermore, combinatory enzymatic assays with the four hydrolases and acetyl xylan esterase did not provide evidence of synergistic effects but demonstrated cooperativity between xylanases and the accessory enzymes. Although feruloyl esterase treatment did not provide evidence of phenolic decorations in any of the arabinoxylans, a detailed biochemical e biophysical characterization demonstrated the optimum activity of this enzyme at 60°C and pH 6.5 and a catalytic efficiency of about 390 s -1.mM-1 against the synthetic substrate ethyl ferulate. The enzyme was stable at high temperature, and active against feruloylated oligosaccharides from wheat bran arabinoxylan showing the great potential of the enzyme for industrial uses.