Este estudo apresenta as propriedades cinéticas e moleculares da (Na+, K+)-ATPase do tecido branquial do G. cruentata, trazendo informações que contribuem para uma melhor compreensão das adaptações fisiológicas e bioquímicas associadas à ocupação de diferentes ambientes pelos crustáceos. A análise por Western Blotting na presença de anticorpo monoclonal para a subunidade da (Na+, K+)-ATPase confirmou a presença da enzima na fração microsomal. A marcação imuno-histoquímica da (Na+, K+)-ATPase nas brânquias posteriores revela que a enzima está distribuída predominantemente na região apical das células pilares. A centrifugação em gradiente de sacarose indicou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, embora dois picos de proteína tenham sido observados para a atividade insensível a ouabaína. A modulação da atividade (Na+, K+)-ATPase de G. cruentata recém-capturado (21S) pelo ATP ocorreu através de duas famílias de sítios, uma de alta afinidade com VM= 153,4 ± 7,7 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,013 ± 0,0006 mmol L-1 e nH = 1,3, e outra de baixa afinidade com VM= 186,0 ± 9,3 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,085 ± 0,004 mmol L-1 e nH= 3,0. Uma atividade basal de aproximadamente 140 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína foi observada em baixas concentrações de ATP (10-9 mmol L-1). Em condições estequiométricas de Mg2+ e ATP apenas a família de baixa afinidade ATP foi observada, apresentando VM= 443,0 ± 22,1 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,06 ± 0,003 mmol L-1 e nH= 4,0. Os resultados sugerem que excesso de Mg2+ atua como um modulador alostérico e estimula o aparecimento da família de alta afinidade pelo ATP. A atividade (Na+, K+)-ATPase dos animais aclimatados também foi estimulada através de duas famílias de sítios ATP em todas as salinidades estudadas. Os íons magnésio estimularam a atividade da (Na+, K+)-ATPase através de uma única curva de saturação, com VM= 425,9 ± 25,5 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,16 ± 0,01 mmol L-1 e nH= 2,6. De forma similar, a atividade (Na+, K+)-ATPase foi estimulada pelo Na+ (VM= 425,0 ± 23,4 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, , KM= 5,1 ± 0,3 mmol L-1 e nH= 1,5), K+ (VM= 485,3 ± 24,3 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,9 ± 0,05 mmol L-1 e nH = 1,5) e NH4+ (VM= 497,4 ± 24,9 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 9,7 ± 0,5 mmol L-1 e nH= 1,2). A enzima é inibida pela ouabaína com Ki= 196,6 ± 9,8 µmol L-1. Além da (Na+, K+)-ATPase, foram identificadas na fração microsomal Na+-, K+- e Ca2+-ATPases além de fosfatases neutra e alcalina. Embora a osmolalidade da hemolinfa dos animais aclimatados não variou significativamente, os caranguejos hiperregulam em baixas salinidades e hiporregulam em salinidades mais altas. Uma expressão significativa da subunidade da (Na+, K+)-ATPase foi observada durante a aclimatação a 10 S enquanto para salinidades mais elevadas (20, 30 e 40 S) não ocorreu uma diferença significativa na expressão. Na presença de NH4+ a atividade da (Na+,K+)-ATPase foi estimulada 6% e, de maneira inesperada, inibida 25% na presença de FXYD2. Entretanto, na presença de NH4+ e FXYD2 ocorreu uma estimulação de 10%, sugerindo que o sitio de ligação do peptídeo FXYD2 requer a presença de NH4+ para ser exposto. A adição de AMPc (estimulador da PKA) e PMA (estimulador da PKC) acarretou a fosforilação da subunidade da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo que a fração microsomal também apresenta PKA e PKC endógenas. A eletroforese em condições desnaturantes confirmou a fosforilação da subunidade da (Na+, K+)-ATPase pela PKA. Além disso ficou demonstrado que a fração microsomal apresenta o peptídeo FXYD2, uma vez que foi observada uma banda fosforilada de aproximadamente 7 kD

This systematic study of the kinetic and molecular properties of G. cruentata (Na+, K+)-ATPase of the gill tissue disclosed information that contributes to a better understanding of the physiological and biochemical adaptations associated to the occupation of different environments by crustaceans. Western Blotting analysis in the presence of a monoclonal antibody against the subunit of (Na+, K+)-ATPase confirmed the presence of the enzyme in the microsomal fraction. Immunohistochemical analysis confirmed that gill (Na+, K+)-ATPase of G. cruentata is predominantly distributed in the apical region of pillar cells. Sucrose gradient centrifugation indicated the presence of a single protein peak showing (Na+, K+)-ATPase activity while two different protein fractions were observed for ouabain-insensitive activity. (Na+, K+)-ATPase activity is modulated by ATP by two ATP binding site families. One of high affinity with VM= 153.4 ± 7.7 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 0.013 ± 0.0006 mmol L-1 and nH = 1.3 and a low-affinity with VM= 186.0 ± 9.3 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 0.085 ± 0.004 mmol L-1 and nH= 3.0. Interestingly, a basal activity of VM= 140 nmol Pi min-1 mg-1 protein was observed at low concentrations of ATP (10-9 mmol L-1). However, under stoichiometric condition of ATP and Mg2+ only a low-affinity family of sites was observed (VM= 443.0 ± 22.1 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 0.06 ± 0.003 mmol L-1 and nH= 4.0) suggesting that excess Mg2+ is an allosteric modulator of the enzyme and is responsible for triggering the high-affinity ATP binding sites. The (Na+, K+)-ATPase activity of the acclimated animals was also stimulated by two ATP binding site families in all salinities studied. Magnesium ions also stimulated the (Na+, K+)-ATPase activity (VM= 425.9 ± 25.5 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 0.16 ± 0.01 mmol L-1 and nH= 2.6), as well as by Na+ (VM= 425.0 ± 23,4 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 5.1 ± 0.3 mmol L-1 and nH= 1.5), K+ (VM= 485.3 ± 24.3 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 0.9 ± 0.05 mmol L-1 and nH = 1.5) and NH4+ (VM= 497.4 ± 24.9 nmol Pi min-1 mg-1 protein, KM= 9.7 ± 0.5 mmol L-1 e nH= 1.2). Ouabain inhibited (Na+, K+)-ATPase activity with Ki= 196.6 ± 9.8 µmol L-1. ATPases other than (Na+,K+)-ATPase were identified in microsomal preparation such as Na+-, K+- and Ca2+-ATPase, along with neutral and alkaline phosphatases. Hemolymph osmolality did not change after acclimation to different salinities, but crabs hyper-regulate at low salinities and hypo-regulate at higher salinities. At low salinities (10 S) a significant expression of (Na+, K+)-ATPase subunit was observed, but no significant difference in expression was observed in salinities higher than 10 S. In the presence of NH4+, (Na+, K+)-ATPase activity was stimulated 6% and inhibited 25% by FXYD2. However, the presence of NH4+ and FXYD2 stimulated the protein 10%, suggesting that for the binding site for FXYD2 peptide to be exposed and passive to binding requires the presence of NH4+. The addition of cAMP (PKA stimulator) and PMA (PKC stimulator) resulted in the phosphorylation of (Na+, K+)-ATPase subunit suggesting that the microsomal fraction also has endogenous PKA and PKC. The electrophoresis under denaturing conditions has confirmed the phosphorylation of (Na+, K+)-ATPase subunit by PKA. In addition, it has also been demonstrated that the microsomal fraction has the FXYD2 peptide since a phosphorylated band of approximately 7 kDa was observed