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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.59.2020.tde-19082020-144507
Documento
Autor
Nome completo
Igor Gustavo de Carvalho Oliveira
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2020
Orientador
Banca examinadora
Nassur, Maria Eugenia Queiroz (Presidente)
Bottoli, Carla Beatriz Grespan
Guimaraes, Elaine Aparecida Del Bel Belluz
Título em português
Desenvolvimento do método SALLE-UHPLC-MS/MS para a determinação de anandamida e 2-araquidonoilglicerol em amostras de encéfalos de ratos submetidos a modelo animal da Doença de Parkinson
Palavras-chave em português
Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem
Doença de Parkinson
Encéfalos de ratos
Endocanabinóides
Extração líquido-líquido assistida por salting-out
Resumo em português
Os endocanabinóides (ECs), anandamida (AEA) e 2-araquidonoilglicerol (2-AG), juntamente dos receptores celulares canabinóides (CB1 e CB2) e enzimas metabólicas, fazem parte do chamado sistema endocanabinóide (eCB). Estudos realizados indicam que os níveis endógenos desses ECs sofrem alterações à estímulos fisiológicos, farmacológicos e patológicos, fazendo com que a determinação de suas concentrações em amostras biológicas sejam alvo de estudos de diversas patologias, com destaque às doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP). Modelos experimentais em animais têm sido desenvolvidos para mimetizar as características da DP observada na clínica em humanos, comumente, a injeção aguda seletiva de neurotoxinas, como o análogo hidroxilado da Dopamina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos, é usada para criar lesões neurodegenerativas agudas das vias nigro-estriatais. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) tem sido considerada a técnica analítica de referência para a determinação de endocanabinóides em amostras biológicas. A extração líquido-líquido assistida por "salting-out" (SALLE) é uma técnica de extração baseada no efeito de "salting-out", que consiste na redução da miscibilidade mútua entre a água e um solvente orgânico miscível em água pela adição de um eletrólito. Como consequência da adição do sal, os analitos orgânicos não carregados presentes na amostra sofrem redução de solubilidade na fase aquosa, favorecendo a migração para a fase orgânica. O objetivo deste projeto foi o desenvolvimento de método SALLE/UHPLC-MS/MS para a determinação de AEA e 2-AG em amostras de encéfalos de ratos induzidos ao parkinsonismo. O procedimento SALLE desenvolvido apresentou como vantagens menor consumo de solvente orgânico e menor tempo de análise, quando comparado às técnicas de extração líquido-líquido e extração em fase sólida, e extratos mais limpos, em razão da separação de fases orgânica/aquosa, quando comparado à precipitação de proteínas. O método SALLE-UHPLC-MS/MS foi validado, apresentando linearidade de 2,00 a 20,00 ng/mL para AEA e 0,300 a 10,00 µg/mL para 2-AG, valores de exatidão (EPR) e precisão (CV) intra e inter-ensaio abaixo de 15% e efeito matriz não significativo. O método proposto foi aplicado com sucesso na determinação das concentrações endógenas de AEA e 2-AG em amostras de encéfalo total, de hemisférios e estriados de ratos parkinsonianos e ratos sadios do grupo controle. Para AEA, verificou-se diferença significativa (p<0,05), entre os estriados ipsilateral e contralateral à lesão. Já ao comparar esses dois grupos de estriados com os estriados dos animais sadios, observou grande diferença estatística (p<0,001). Para 2-AG, observou-se grande diferença estatística (p<0,001) ao se comparar as concentrações entre os estriados ipsilateral e contralateral à lesão. Da mesma forma, observou-se grande diferença estatística (p<0,001) entre os estriados ipsilateral e contralateral dos animais lesionados com os animais sadios.
Título em inglês
Development of the SALLE-UHPLC-MS/MS method to determine anandamide and 2-arachidonoylglycerol in rat brain samples submitted to a Parkinson's Disease animal model
Palavras-chave em inglês
Endocannabinoids
Liquid chromatography tandem mass spectrometry
Parkinsonss disease
Rat brain samples
Salting-out assisted liquid-liquid extraction
Resumo em inglês
The endogenous compounds anandamide (AEA) and 2-arachidonoylglycerol (2-AG), derived from the arachidonic acid, are part of a neurotransmitters class known as endocannabioids (ECs) that, together with the cellular cannabinoid receptors (CB1 and CB2) and metabolic enzymes, compose the endocannabinoid system (eCB). Studies indicate that the endogenous concentrations of these ECs suffers variations to physiological, pharmacological and pathological stimuli, making the determination of their concentrations in biological samples to be the target of studies of several pathologies, with emphasis on neurodegenerative diseases, such as Parkinson's Disease (PD). Experimental animal models have been developed to mimic the characteristics of PD observed in the clinic in humans, commonly, the selective acute injection of neurotoxins, such as the hydroxylated analogue of dopamine, 6-hydroxidopamine (6-OHDA) in rats, is used to create acute neurodegenerative lesions on the nigrostriatal pathways. Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry has been considered the reference technique in the determination of endocannabinoids in biological samples. The sample preparation step has been required in the development of chromatographic methods, to eliminate interfering agents and to pre-concentrate the analytes, usually present at trace levels in biological samples. The salting-out assisted liquid-liquid extraction (SALLE) is an extraction technique based on the "salting-out" effect, which consists in reducing the mutual solubility between water and a water-miscible organic solvent by the addition of an electrolyte. In function of the salt addition, the uncharged organic analytes present in the sample undergo a reduction of solubility in the aqueous phase and are extracted in the organic phase. The developed SALLE method presented the advantage of consuming lower organic solvent volume and shorter analysis time when compared to conventional liquid-liquid extraction and solid phase extractions. In addition, the SALLE technique presented cleaner extracts due to the separation of organic/aqueous phases, when compared to protein precipitation. The SALLE-UHPLC-MS/MS method was validated, presenting linear range from 2.00 to 20.00 ng/mL for AEA and from 0.30 to 10.00 µg/mL for 2-AG, values of intra-and inter-assay accuracy (CV) and precision (RSD) bellow 15%, and no significate matrix effect. The proposed method was successfully applied to determine the endogenous concentrations of AEA and 2-AG in samples of total brain, hemispheres and striatum from parkinsonian rats and healthy rats from the control group. For AEA, there was a significant difference (p<0.05) between the ipsilateral and contralateral striatums. When comparing these two groups of striatums with striatums of healthy animals, there was a large statistical difference (p <0.001). For 2-AG, a large statistical difference (p <0.001) was observed when comparing the concentrations between the ipsilateral and contralateral striatums. Likewise, a large statistical difference (p <0.001) was observed between the ipsilateral and contralateral striatum of the injured animals with the healthy animals.
 
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Data de Publicação
2020-11-20
 
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