O tecido ósseo é constituído pela combinação de uma matriz de colágeno e uma matriz mineral, que é formada por cristais de fosfato de cálcio, sob a estrutura de hidroxiapatita. Este processo de acúmulo de mineral no tecido ósseo é denominado biomineralização e é realizado por células chamadas osteoblastos, por intermédio da liberação de vesículas da matriz (MVs). Estas vesículas surgem por brotamento das superfícies das células e são secretadas no local específico do início da biomineralização na matriz do tecido ósseo. MVs contém altas concentrações de íon Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias várias proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições bastante particulares. Uma atenção especial deve ser dada a algumas proteínas presentes nas MVs: Anexina A5 (AnxA5) e Anexina A6 (AnxA6) e a Fosfatase Alcalina de tecido não especifica (TNAP). A AnxA6, foco de estudo desta tese, é o maior membro da família das anexinas presentes nas MVs, com aproximadamente 68 kDa. Análises bioquímicas revelaram que ela está presente em três regiões distintas nas MVs, indicando diversas funções durante o processo de mineralização. Buscamos neste estudo, compreender características e possíveis funções da AnxA6, comparando muitos de nossos achados com o que temos disponível na literatura em relação a AnxA5. O estudo revelou que em pH 6,5, 86% da estrutura da AnxA6 está na conformação α-hélice enquanto que a AnxA5 apresentou maior quantidade de α-hélice em pH 8 (~50%). Utilizando-se medidas de potencial zeta, foi possível determinar o ponto isoelétrico de 4,2 para a AnxA6. Os demais estudos foram realizados utilizando monocamadas e proteolipossomos composto de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) para mimetizar a lamela externa da bicamada de MV e eventualmente para imitar a lamela interna utilizou-se uma mistura de 9:1 DPPC:dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) com e sem Ca2+. Confirmamos que, de acordo com os dados bioquímicos, a AnxA6 interage de forma diferente com a membrana da MV. Análises termodinâmicas baseadas em medidas de pressão de exclusão superficial (πexc), entalpia (ΔH) e cooperatividade de transição de fase (ΔT1/2) mostraram que a AnxA6 interage com DPPC e 9:1 DPPC:DPPS, sendo que esta interação se tornou maior na presença de colesterol (Chol) (6:4 DPPC:Chol e 5:4:1 DPPC:Chol:DPPS). A interação AnxA6-lipídio também se mostrou Ca2+-dependente, conforme evidenciado pelo aumento na πexc em monocamadas carregadas negativamente de 9:1 DPPC:DPPS bem como, diminuição de ΔH em proteolipossomos desta composição lipídica causada pela adição da AnxA6 na presença de Ca2+ em comparação às bicamadas zwitteriônicas de DPPC. A interação da AnxA6 com DPPC e 9:1 DPPC:DPPS foi distinta mesmo na ausência de Ca2+, conforme observado por uma maior alteração nos valores de ΔT1/2 nas vesículas de 9:1 DPPC:DPPS em comparação com as vesículas DPPC. Imagens obtidas por microscopia de força atômica (AFM) revelaram protrusões na superfície dos proteolipossomos de DPPC e 5:4:1 DPPC:Chol:DPPS o que sugere que a AnxA6 oligomérica interagiu com a membrana das vesículas e que pode adotar conformações diferentes quando interage com a membrana lipídica. Estudos de mineralização in vitro foram realizados com a finalidade de verificar se a presença da AnxA6 (em solução ou associado a proteolipossomos) e Colágeno Tipo I levariam a propagação mineral. Foram utilizados como nucleadores o fosfato de cálcio amorfo (ACP) e sua forma mais estável associada à fosfatidilseria (PS-CPLX). Por meio de medidas de turbidez e análises de Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), verificou-se a AnxA6, em solução, e proteolipossomos com o nucleador PS-CPLX na ausência de colágeno tipo I, apresentaram melhores indícios de propagação mineral. A AnxA6 mostrou baixa capacidade de propagação de nucleação incorporada superficialmente em lipossomos, tal fato sugere que seu melhor desempenho seja na nucleação mineral.

The bone tissue consists of a collagen and mineral matrix combination formed by calcium phosphate crystals converted into a hydroxyapatite. This mineral accumulation process in the bone tissue is called biomineralization and it is performed by osteoblasts cells throughout matrix vesicles (MVs) release. MVs are a special class of extracellular vesicles that serve as a nucleation site during bone mineralization. MVs have high Ca2+ and inorganic phosphate (Pi) concentration, thus, providing a suitable microenvironment for the initial mineral formation and propagation. Several proteins/enzymes are needed as well as microenvironments of MVs in very peculiar conditions in order to perform the correct biomineralization. Special attention must be given to some proteins present in MVs: Annexin A5 (AnxA5) and Annexin A6 (AnxA6) and the Tissue Non-specific Alkaline Phosphatase (TNAP), being, AnxA6 the focus of this study. AnxA6 is the largest member of the annexin family present in MVs, with ~68 kDa. Biochemical analysis revealed that AnxA6 is present in three different positions of membrane MVs, which indicates it plays different roles in the mineralization process. In this study, we were able to understand its biochemical/biophysical characteristics and possible functions by comparing many of our findings with what we have found in the literature regarding AnxA5. At pH 6, AnxA6 has shown 86% of its structure in an α-helix conformation, whereas AnxA5 has shown ~50% of its α-helix content at pH 8. Using zeta potential measurements, the isoelectric point was determined as 4.2 for AnxA6. Using monolayers and proteoliposomes composed of either dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) to mimic the outer leaflet of the MV membrane bilayer or a 9:1 DPPC:dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) mixture to mimic the inner leaflet, with and without Ca2+, we confirmed that, in agreement with the biochemical data, AnxA6 interact differently with the MV membrane. Thermodynamic analyses based on the measurement of surface pressure exclusion (πexc), enthalpy (ΔH), and phase transition cooperativity (ΔT1/2) showed that AnxA6 interacted with DPPC and 9:1 DPPC:DPPS and that this interaction increased in the presence of cholesterol (Chol) (6:4 DPPC:Chol and 5:4:1 DPPC:Chol:DPPS). AnxA6-lipid interaction was also Ca2+ - dependent, as evidenced by the increase in πexc in negatively charged 9:1 DPPC:DPPS monolayers and the decrease in ΔH in 9:1 DPPC:DPPS proteoliposomes caused by the addition of AnxA6 in the presence of Ca2+ compared to DPPC zwitterionic bilayers. The interaction of AnxA6 with DPPC and 9:1 DPPC:DPPS was distinct even in the absence of Ca2+ as observed by the larger change in ΔT1/2 in 9:1 DPPC:DPPS vesicles as compared to DPPC vesicles. Protrusions on the surface of DPPC and 5:4:1 DPPC:Chol:DPPS proteoliposomes observed by atomic force microscopy (AFM) suggested that oligomeric AnxA6 interacted with the vesicle membrane may adopt different conformations upon interaction with the lipid membrane. In vitro mineralization studies were carried out in order to verify if the presence of AnxA6 (in solution or associated to proteoliposomes) and Collagen Type I would lead to mineral propagation. Amorphous calcium phosphate nucleators (ACP) or along with its more stable form associated with phosphatidylserine (PS-CPLX) were used as nucleator. Turbidity and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) analyzes have presented that AnxA6 in solution as well as in proteoliposomes with the PS-CPLX nucleator in the absence of collagen type I, better mineral propagation evidences. AnxA6 lacks nucleation propagation capacity incorporated superficially into liposomes suggesting that it may play an important role in mineral nucleation.