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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.59.2016.tde-17042016-155242
Documento
Autor
Nome completo
Gustavo Avelar Molina
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2016
Orientador
Banca examinadora
Ward, Richard John (Presidente)
Guimarães, Francisco Eduardo Gontijo
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
Título em português
Caracterização biofísica da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11
Palavras-chave em português
Biofísica
Catálise enzimática
Dinâmica molecular
Xilanase GH11
Resumo em português
A dinâmica estrutural fundamentando a função das xilanases GH11 ainda não está clara. Novo conhecimento sobre a dinâmica catalítica dessas enzimas é crucial para a engenharia de novas enzimas melhoradas beneficiando, assim, diversas indústrias biotecnológicas e de química verde. Com base nesse fato, esse trabalho teve por objetivo obter novas informações acerca da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11, através do uso de um conjunto de diversas técnicas avançadas de biofísica molecular em nível bulk e em nível de molécula única (inglês single molecule ou sm). Para isso, foram projetadas xilanases GH11 de Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) com mutações únicas de cisteína para a marcação dos resíduos D119 e R122 no domínio polegar, do resíduo N54 no domínio dedos, e do resíduo N151 na alfa-hélice, seguidas pela sua construção e produção por métodos de biologia molecular. Esses mutantes foram marcados em seus respectivos grupos tióis com a sonda fluorescente sensível à polaridade Acrylodan, com a sonda de spin MTSSL, e com a sonda fluorescente fotoestável AttoOxa11. A xilanase tipo selvagem for marcada em seu N-terminal com a sonda fotoestável Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Foram utilizados ensaios de espectrofotometria de fluorescência em nível bulk e de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica para investigar como a dinâmica do domínio polegar da xilanase GH11, temperatura, e ligação ao substrato se correlacionam um com o outro. Os resultados atestaram que um estado do domínio polegar controlado por temperatura, aberto, dinâmico e flexível tem mais chances de se ligar efetivamente ao substrato de uma maneira produtiva, o que está em completo acordo com estudos anteriores de simulação de dinâmica molecular, cristalografia, desnaturação térmica, e análise funcional por desenho racional de mutantes de domínio polegar de xilanases GH11. Com base nas evidências adquiridas e em estudos anteriores, nós propomos um conjunto de hipóteses e modelos para a dinâmica catalítica da xilanase, focando no papel do domínio polegar nesse processo. No intuito de determinar a constante de afinidade da xilanase por seu substrato e os tempos de relaxamento e constantes de velocidade dos movimentos do domínio polegar, foram feitas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência simples e combinada com transferência eletrônica fotoinduzida, usando as xilanases marcadas com as sondas fluorescentes fotoestáveis, na presença e na ausência de substrato. Os resultados mostraram tempos de difusão muito maiores para as xilanases na presença de substrato, como efeito da afinidade da enzima pelo mesmo. Entretanto, não foi verificada nenhuma curva de decaimento como efeito de supressão dinâmica da sonda por PET. Esses mesmos conjugados foram aplicados com sucesso em microscopia por imagem de tempo de vida de fluorescência, no intuito de analisar sistematicamente a afinidade da xilanase por partículas insolúveis e filmes de substrato, e por fragmentos insolúveis de frações de processos de deslignificação e desestruturação de bagaço de cana-de-açúcar, assim como para a análise da composição, estrutura e topologia desses materiais. Foi possível verificar a presença de xilano na maioria das frações desse bagaço tratado, mas em quantidades variáveis
Título em inglês
Biophysical characterization of the catalytic dynamics of a GH11 xylanase
Palavras-chave em inglês
Biophysics
Enzyme catalysis
GH11 xylanase
Molecular dynamics
Resumo em inglês
The structural dynamics underlying the function of GH11 xylanases is still unclear. New insights into the catalytic dynamics of these enzymes are crucial for engineering novel improved enzymes benefiting biotechnological and green chemistry industries. The objective of this work was to obtain new information concerning the catalytic dynamics of a GH11 xylanase, by using a combination of advanced molecular biophysics techniques, both at the bulk level and at the single molecule level (sm). Mutant GH11 xylanases from Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) were designed with single point cysteine mutations for labeling the residues D119 and R122 on the thumb domain, N54 on the fingers domain, and N151 on the alpha helix, followed by their construction and production by molecular biology methods. These mutants were labeled at their respective thiol groups by the polarity sensitive fluorescent probe Acrylodan, by the electron spin probe MTSSL, and by the photostable fluorescent probe AttoOxa11. The wild-type xylanase was labeled at its N-terminus by the photostable fluorescent probe Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Bulk fluorescence spectrophotometry and electron paramagnetic resonance assays were used to investigate how the thumb domain dynamics of the GH11 xylanase, temperature and substrate binding were correlated. These results demonstrated that a temperature controlled, open, dynamical and flexible thumb domain state is more likely to effectively bind the substrate in a productive way, which is in complete agreement with previous studies from molecular dynamics simulations, crystallography, thermal denaturation, and function analysis by the rational design of thumb mutants for GH11 xylanases. Based on this evidence and previous studies, we proposed a hypothesis for the xylanase catalytic dynamics, focusing on the role of the thumb domain. In order to determine the xylanase affinity constant for its substrate and the relaxation times and rate constants of the thumb domain movements, fluorescence correlation spectroscopy measurements were performed. Both simple and combined measurements with photoinduced electron transfer were performed, using the xylanases labeled with photostable fluorescent probes, in the presence and absence of substrate. The results have shown longer diffusion times for the xylanases in the presence of substrate, as an effect of the enzyme affinity for it. However, it was not verified any decay curve as an effect of the dynamic suppression of the probe via PET. The same conjugates were successfully applied to fluorescence-lifetime imaging microscopy, aiming to systematically analyze the affinity for xylanase of substrates in the form of insoluble particles and films, and for water insoluble fractions from sugarcane bagasse delignification processes. In addition, the composition, structure and topology of these materials was examined. It was possible to verify the presence of xylan in most fractions of this treated bagasse, although in variable quantities
 
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Data de Publicação
2016-08-16
 
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