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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.59.2014.tde-16072020-135259
Document
Author
Full name
Juliana Sakamoto Yoneda
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2014
Supervisor
Committee
Ciancaglini, Pietro (President)
Araujo, Ana Paula Ulian de
Beltramini, Leila Maria
Itri, Rosangela
Jorge, Rosa dos Prazeres Melo Furriel
Title in Portuguese
Estudos biofísicos da interação entre a Na,K-ATPase e a subunidade gama, ATP, Na+, K+, DPPC, DPPE e colesterol
Keywords in Portuguese
Agregação proteica
Calorimetria
Estabilidade térmica
Na,K-ATPase
Oligomerização
Abstract in Portuguese
A Na,K-ATPase (NKA) é expressa em todas as células animais e é um dos membros mais importantes da família das ATPases do tipo P. Consiste de três subunidades: α, β e γ. Essa proteína é responsável por gerar o gradiente eletroquímico de Na+ e K+ através da membrana plasmática pelo uso da energia derivada da hidrólise de ATP. Neste trabalho estudos da termoestabilidade da Na,K-ATPase foram feitos. Os resultados mostraram que a fração de membrana rica em NKA alcançou a máxima estabilidade térmica entre as amostras analisadas. Após a solubilização da proteína com C12E8, a estabilidade da NKA diminuiu pela metade, no entanto, essa amostra solubilizada possuía atividade enzimática. Pela análise dos valores de variação de entalpia total (ΔHt) foi possível observar que a adição do extrato contendo a subunidade γ à enzima solubilizada (α/β) levou à formação do complexo (αβγ) com maior estabilidade térmica. Um aumento em ΔHt também foi verificado quando a NKA solubilizada foi reconstituída em sistemas de lipossomos. A conformação E2, induzida pelos íons K+, foi duas vezes mais estável que a conformação E1, que é induzida pelos íons Na+. A interação da conformação E2 com o substrato ATP não modificou o valor de variação de entalpia, mas com a liberação dos íons K+ ocorreu uma mudança conformacional, que foi suficiente para resultar em um termograma com um perfil diferente. Além do estudo de estabilidade térmica, a calorimetria também foi utilizada com o propósito de estudos cinéticos da NKA. Os parâmetros (Km e Vmáx) foram determinados e os valores de Km obtidos estavam dentro da faixa submilimolar esperada. A utilização de duas concentrações diferentes de proteína resultou em curvas de titulação calorimétrica distintas o que nos levou a especular que a mudança no perfil poderia ser explicada pelo estado oligomérico que a NKA assumiu em solução dependendo da sua concentração. Os resultados obtidos pelas técnicas de Espalhamento Dinâmico de Luz e Ultracentrifugação Analítica mostraram que a amostra de NKA se divide em diferentes populações oligoméricas em solução. As principais populações são de monômero - (αβ) e tetrâmero - (αβ)4. Há também a formação de um agregado inespecífico que pode ser retirado por filtração simples, mas que com o tempo volta a se formar em solução. E finalmente, os experimentos de ITC mostraram que provavelmente ocorre uma interação direta do colesterol com a NKA.
Title in English
Biophysical studies of the interaction between the Na, K-ATPase and gamma subunit, ATP, Na+, K+, DPPC, DPPE and cholesterol
Keywords in English
Calorimetry
Na K-ATPase
Oligometrization
Protein aggregation
Thermostability
Abstract in English
Na,K-ATPase (NKA) is expressed in all animal cells. It is an important member belonging to the family of P-type ATPases. This protein uses the energy derived from ATP hydrolysis to generate electrochemical gradient of Na+ and K+ across the plasma membrane. The Na,K-ATPase consists of α, β and γ subunits. In this work, the thermostability of the NKA was analyzed in different conditions. The membrane-bound NKA reached the highest thermal stability. After the solubilization with C12E8, the stability of this enzyme decreased by half, although the protein retained its enzymatic activity. When the extract containing the γ subunit was introduced into the solubilized enzyme, the αβγ complex reached higher stability compared to (αβ). This attests to an important structural role of gamma subunit γ in addition to its regulatory function. A recovery of the stability can also be verified when solubilized NKA is reconstituted into liposome vesicles, corroborating the crucial role of lipids in the protein stabilization. The conformation E2, induced by K+, was twice more stable than the conformation E1, induced by Na+. The interaction of the substrate ATP with conformation E2 did not modify the value of total enthalpy variation, but the release of ions K+ caused a conformation change which was enough to promote a different thermogram profile. Further, the calorimetry was also used for the purpose to kinetic studies of the NKA. The kinetic parameters (Km and Vmáx) were obtained and the Km values were within the expected submillimolar range. Using multiple injection method, the curves obtained for two protein concentrations were different. This led us to speculate that the different profile could be explained by the oligomeric state that NKA assumes in solution dependent on its concentration. In order to unveil this question, an aggregation and oligomerization study, using the techniques Dynamic Light Scattering and Analytical Ultracentrifugation was performed. The results showed that NKA is divided into different populations of oligomers in solution. The main populations are monomer - (α/β) and tetramer - (α/β)4. There is also the formation of a nonspecific aggregate that can be removed by a simple filtration, but it is formed again in solution over time. Finally, the ITC experiments showed that the direct interaction of cholesterol with NKA probably occurs.
 
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Publishing Date
2020-11-23
 
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