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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.59.2009.tde-15102009-080134
Documento
Autor
Nome completo
Leila Spinola e Castro
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2009
Orientador
Banca examinadora
Ward, Richard John (Presidente)
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
Paulino, Tony de Paiva
Título em português
Clonagem e expressão dos domínios 2 e 3 do receptor KDR (VEGFR-2) humano
Palavras-chave em português
PLA2Lys49
Proteína.
Receptor Domínio Quinase (KDR)
Resumo em português
Em condições patológicas como o câncer, a angiogênese, ou seja, o crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente, resulta numa maior oxigenação e nutrição das células e, consequentemente, num rápido crescimento do tumor [1]. Uma variedade de fatores estimulam a angiogênese, entre eles o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e seus receptores (VEGFR). O VEGF é uma proteína homodimérica cujas atividades biológicas são reguladas através da ligação com seu próprio receptor domínio quinase (kinase domain receptor KDR). Dos sete domínios extracelulares de Ig-like no KDR, apenas os domínios dois e três são necessários para uma ligação de alta afinidade com o VEGF. Yamazaki e colaboradores, em 2005, relataram que um componente protéico designado KDRbp (KDR-binding protein) da peçonha da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus liga-se ao domínio extracelular de KDR com alta afinidade, resultando no bloqueio subnanomolar de VEGF. Yamazaki et.al. demonstrou que KDRbp exibe a sequência de aminoácidos da região N-terminal e de fragmentos enzimaticamente digeridos da sequência peptídica de KDR-bp é idêntica a Lys-49-fosfolipase A2, um homólogo inativo da fosfolipase A2, no qual a Lys-49 substitui Asp-49. Diante disso, este trabalho teve por objetivo a síntese funcional de uma sequência de nucleotídeos correspondente aos domínios 2 e 3 do Receptor-2 do Fator do Crescimento Endotelial Vascular in vitro que, ao ser expressa em bactéria Escherichia coli (E.coli), permita aplicações otimizadas de seus códons. O cDNA (HUVEC) de KDR que serviu de molde para a amplificação pela reação em cadeia da polimerase para a obtenção do DNA de 675 pares de bases (pb) que codificam 225 aminoácidos correspondentes aos domínios 2 e 3 de KDR. Visando a otimização do uso de códons da construção do DNA que podem prontamente aperfeiçoar os códons para a expressão da proteína em todo o organismo do hospedeiro, no caso, a bactéria Escherichia coli (E.coli), foi desenhada e sintetizada uma sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR (constructo 2 e 3 do KDR). O constructo 2 e 3 do KDR obtido por PCR foi expresso em E.coli BL21 usando o vetor de expressão pET28a. A técnica de obtenção de uma sequência de nucleotídeos partindo do cDNA correspondente a sequência desejada é bastante utilizada por sua praticidade de manipulação e rapidez no resultado. A ORF (open reading frame) que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor pET28a e a expressão foi induzida por IPTG. A análise da expressão foi monitorada e observado o sucesso devido a obtenção de proteína de 25 kDa expressos.
Título em inglês
Cloning and Expression of the 2 and 3 Domains KDR Receptor (VEGFR-2) Human
Palavras-chave em inglês
PLA2Lys49
Protein
Receptor Domain Kinase (KDR)
Resumo em inglês
In pathologic conditions as cancer, angiogenesis can be stimulated with new blood-vessel formation, oxygenation, and nutrition, leading to a rapid growth of tumor. A variety of factors can stimulate angiogenesis. Among these factors, there is vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors (VEGFR). VEGF is homodimeric protein which biological activities are regulated by their kinase domain receptor KDR. From the seven KDR Ig-like domains, only domains 2 and 3 are necessary for a VEGF high-affinity binding. Yamazaki et.al. 2005, report that a protein component designated as KDR-binding protein (KDR-bp) from the venom of eastern cottonmouth (Agkistrodon piscivorus piscivorus) binds to high affinity extracellular KDR resulting in subnanomolar block of VEGF. Yamazaki et.al. demonstrated that KDR-bp exhibits the N-terminal amino acid sequence region, and enzymatically digested fragments of KDR-bp peptide sequence, which is identical to Lys-49-fosfolipase A2, an inactive homologue of phospholipase A2 where Lys-49 replaces Asp-49. Herein, this work aimed the functional synthesis of a nucleotide sequence corresponding to domains 2 and 3 from Receptor-2 of vascular endothelial growth factor in vitro expressed in Escherichia coli (E.coli), it allows to applications optimized of its códons. The cDNA (HUVEC) of KDR was used as amplification model by polymerase chain reaction to obtain the DNA of 675 base pairs that codify 225 amino acids related to domains 2 and 3 of KDR. A codifying sequence for domains 2 and 3 of KDR (construct 2/3 KDR) was designed and synthesized for optimal use of DNA construction codons, which are readily able to improve the expression codons of the proteins thorough the host organism, in this case bacteria Escherichia coli (E.coli). The construct2/3 KDR obtained by PCR was expressed in E.coli BL21 with expression vector pET28a. The technique to obtain a nucleotide sequence from cDNA related to the desired sequence is largely used due to easy manipulation and rapid time to results. The codifying ORF (open reading frame) for the target protein was cloned in pET28a vector and expression was induced by IPTG. The expression analysis was monitored and success was observed due to 25 kDa of protein expressed.
 
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dissertacao.pdf (1.91 Mbytes)
Data de Publicação
2009-10-19
 
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