A identificação de compostos que se liguem especificamente a alvos biológicos e que atuem como inibidores enzimáticos tem grande importância nos estudos de desenvolvimento de novos fármacos. Tal paradigma estimula o desenvolvimento de novos métodos de triagem para facilitar e reduzir o tempo de identificação dessas substâncias. Nesse contexto, os biorreatores com enzimas imobilizadas ou IMERs (do inglês immobilized enzyme reactors) têm se destacado como uma alternativa promissora aos ensaios de triagem convencionais. As enzimas calicreínas teciduais (KLKs, do inglês kallikreins) e ciclooxigenases (COXs) humanas desempenham papel importante em diversos processos fisiopatológicos no organismo. A desregulação na expressão e/ou atividade das KLKs, por exemplo, tem sido associada a diversas patologias como doenças de pele, desordens neurológicas e câncer, o que tem despertado considerável interesse na busca de inibidores de KLK. Já as COXs estão envolvidas na biossíntese de prostaglandinas, e são alvos de interesse nos estudos de desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Considerando a importância desta temática, este trabalho descreve a imobilização covalente da enzima KLK pancreática de porco em matriz de Sepharose-NHS, produzindo os biorreatores KLK-Sepharose-NHS. A enzima KLK imobilizada foi empregada em uma metodologia de ensaio off-line em formato multi-poços com detecção por fluorescência. KLK-Sepharose-NHS apresentou elevada atividade recuperada e manteve a habilidade de reconhecer o substrato sintético Z-Phe-ArgAMC. Foram realizados estudos de inibição utilizando leupeptina como inibidor de referência para determinação da potência inibitória (IC50 = 0,13 ± 0,01 µmol L-1 ) e mecanismo de inibição. Também avaliamos várias matrizes complexas (extratos de plantas e meios microbiológicos) para demonstrar a aplicabilidade de KLKSepharose-NHS. Outra proposta deste trabalho foi o desenvolvimento de ensaio off-line baseado em microcolunas de KLK imobilizada (IMER-KLK-Sepharose-NHS) com detecção por espectrometria de massas. Utilizando tal método foi possível determinar as condições ótimas do ensaio enzimático e os parâmetros cinéticos (KM = 16,3 ± 2,1 µmol L-1 ) para a enzima imobilizada, bem como realizar os estudos de inibição utilizando leupeptina como inibidor de referência (IC50 = 0,89 ± 0,12 µmol L-1 ). De maneira geral, a enzima KLK imobilizada mostrou ótima capacidade de reutilização e foi capaz de reconhecer o inibidor de referência (leupeptina), demostrando que os modelos de ensaio propostos podem ser aplicados na triagem de inibidores. Este trabalho também descreve os esforços para imobilização da enzima COX-2 humana em capilares de sílica fundida e o estudo das condições de uso dos biorreatores em metodologia de ensaio on-line por cromatografia líquida de alta de eficiência e espectrometria de massas.

The identification of compounds that specifically bind to biological targets and act as enzyme inhibitors is of great importance in studies of new drug development. This paradigm stimulates the development of new screening methods to facilitate and reduce the time taken to identify such substances. In this context, immobilized enzyme bioreactors or IMERs have emerged as a promising alternative to conventional screening assays. Human tissue kallikreins (KLKs) and cyclooxygenases (COXs) enzymes play an important role in various pathophysiological processes. The deregulation of KLK expression and activity, for example, has been associated with several pathologies such as skin diseases, neurological disorders and cancer, which has aroused considerable interest in the search for KLK inhibitors. COXs enzymes are involved in the prostaglandin biosynthesis, and they are targets of interest in studies on the development of new anti-inflammatory drugs. In this context, this work describes the covalent immobilization of the enzyme KLK from porcine pancreas in a Sepharose-NHS matrix, producing the KLK-Sepharose-NHS bioreactors. The immobilized enzyme was used in an off-line fluorescent microplate assay. KLK-Sepharose-NHS showed high recovered activity and maintained the ability to recognize the synthetic substrate Z-Phe-Arg-AMC. Inhibition studies were performed using leupeptin as a reference inhibitor to determine inhibitory potency (IC50 = 0,13 ± 0,01 µmol L-1 ) and inhibition mechanism. We also evaluated several complex matrixes (plant crude extract and microbiological media) to demonstrate the KLK-Sepharose-NHS applicability. This work also describes the development of an off-line assay based on immobilized KLK microcolumns (IMER-KLK-Sepharose-NHS) with detection by mass spectrometry. Using such method, it was possible to determine the optimal conditions of the enzyme assay and the kinetic parameters (KM = 16,3 ± 2,1 µmol L-1 ) for the immobilized enzyme, as well as performing the inhibition studies using leupeptin as standard inhibitor (IC50 = 0,89 ± 0,12 µmol L-1 ). In general, the immobilized enzyme showed excellent reusability and was able to recognize the standard inhibitor (leupeptin), demonstrating that the proposed assay models can be applied in the inhibitors screening. This work also describes the immobilization of human recombinant COX-2 enzyme in fused silica capillaries and the study of the conditions of use of bioreactors in online assay methodology by using high performance liquid chromatography and mass spectrometry.