As enzimas β-secretase1 (BACE1) e acetilcolinesterase (AChE), são enzimas diretamente relacionadas ao desenvolvimento de doenças neurológicas como a Doença de Alzheimer (DA) e são alvos biológicos relevantes no desenvolvimento de novos fármacos para tais enfermidades. Nesse contexto, os inibidores enzimáticos representam uma importante estratégia de tratamento e a identificação de compostos que apresentem seletiva capacidade inibitória e baixo efeito colateral é um paradigma do desenvolvimento de novos fármacos para DA. Os tratamentos disponíveis para DA limitam-se ao uso de inibidores da AChE eficientes em fases iniciais da doença. A complexidade e multifatorialidade da DA tem levado ao entendimento sobre a necessidade de identificação de inibidores que atuem em multialvos biológicos, o que demanda o desenvolvimento de ensaios que possam contribuir no entendimento do mecanismo inibitório na presença desses múltiplos alvos. A identificação de compostos com atividade biológica seja de origem sintética ou a partir de misturas complexas como os extratos naturais é uma etapa crucial no desenvolvimento de fármacos e altamente dependente de triagem desses compostos através de ensaios robustos, eficientes e confiáveis. Nesse contexto, esse trabalho apresenta o estudo das condições no desenvolvimento de um método on-line de triagem de ligantes monitorando a modulação da atividade catalítica utilizando as enzimas BACE-1 e AChE covalentemente coimobilizadas em suportes sólidos (suporte-AChE-BACE-1). Após a coimobilização a determinação de constantes cinéticas (Kmapp) e potência inibitória (IC50), de ambas enzimas demostrou a eficiência da imobilização ao não ser observado comprometimento na conformação ativa das enzimas nem prejuízo às suas atividades catalíticas. O método qualificado foi aplicado na triagem de 60 amostras de origem sintética e os resultados comparados à triagem utilizando as mesmas enzimas imobilizadas individualmente. Foram observadas diferenças nas porcentagens de inibição obtidas durante a triagem. Por exemplo, o composto PQM-185 inibiu em maior porcentagem a BACE1 imobilizada individualmente do que a BACE1 coimobilizada com a AChE. São necessárias a determinação de mais constantes cinéticas como constante de inibição e de dissociação para descobrir a origem destas diferenças. Uma estratégia para triagem de ligantes em amostras complexas como extratos naturais envolve o uso da afinidade desses ligantes pela biomolécula, diminuindo o número de candidatos e o tempo despendido nessa etapa. Nesse contexto, foi desenvolvido um método de pesca de ligantes off-line com as enzimas BACE-1 e AChE covalentemente coimobilizadas em partículas magnéticas (MB). Nesse método, após a incubação da amostra com as enzimas MB-AChE-BACE-1, são realizadas etapas de limpeza onde os compostos com afinidade baixa permanecem no sobrenadante e etapas de extração subsequentes nas quais os compostos com maior retenção são removidos utilizando-se uma porcentagem de solvente orgânico. O método foi qualificado com inibidores avaliados no ensaio de atividade realizado no capilar AChE-BACE1, e aplicado em extratos de origem natural onde foi possível observar ligantes presentes na etapa de extração. As enzimas imobilizadas em partículas apresentaram alta atividade e estabilidade durante o armazenamento por 2 meses.

The β-secretase1 (BACE1) and acetylcholinesterase (AChE) enzymes are enzymes directly related to the development of neurological diseases such as Alzheimer's Disease (AD) and are relevant biological targets in the development of new drugs for such diseases. In this context, enzyme inhibitors represent an important treatment strategy and the identification of compounds that present selective inhibitory capacity and low side effects is a paradigm for the development of new drugs for AD. Available treatments for AD are limited to the use of effective AChE inhibitors in early stages of the disease. The complexity and multifactorial nature of AD has led to the understanding of the need to identify inhibitors that act on biological multitargets, which requires the development of assays that can contribute to the understanding of the inhibitory mechanism in the presence of these multiple targets. The identification of compounds with biological activity, whether of synthetic origin or from complex mixtures such as natural extracts, is a crucial step in drug development and highly dependent on screening these compounds through robust, efficient and reliable assays. In this context, this work presents the study of conditions in the development of an online method for screening ligands monitoring the modulation of catalytic activity using BACE-1 and AChE enzymes covalently coimmobilized on solid supports (support-AChE-BACE-1). After co-immobilization, the determination of kinetic constants (Kmapp) and inhibitory potency (IC50) of both enzymes showed the efficiency of immobilization as there was no impairment in the active conformation of the enzymes or damage to their catalytic activities. The qualified method was applied to the screening of 60 samples of synthetic origin and the results compared to screening using the same immobilized enzymes individually. Differences in the percentages of inhibition obtained during screening were observed. For example, the compound PQM-185 inhibited BACE1 individually immobilized to a greater extent than BACE1 co-immobilized with AChE. More kinetic constants such as inhibition and dissociation constants are needed to discover the origin of these differences. A strategy for screening for ligands in complex samples such as natural extracts involves using the affinity of these ligands for the biomolecule, reducing the number of candidates and the time spent in this step. In this context, an offline ligand fishing method was developed with BACE-1 and AChE enzymes covalently co-immobilized on magnetic particles (MB). In this method, after incubation of the sample with the MB-AChE-BACE-1 enzymes, cleaning steps are performed where compounds with low affinity remain in the supernatant and subsequent extraction steps in which the compounds with higher retention are removed using a percentage of organic solvent. The method was qualified with inhibitors evaluated in the activity assay performed in the AChE-BACE1 capillary, and applied to extracts of natural origin where it was possible to observe ligands present in the extraction step. Enzymes immobilized on particles showed high activity and stability during storage for 2 months.