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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.59.2020.tde-09022021-120951
Documento
Autor
Nome completo
Sibeli de Carli
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2020
Orientador
Banca examinadora
Ward, Richard John (Presidente)
Damasio, André Ricardo de Lima
Grandis, Adriana
Polizeli, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes
Título em português
Engenharia de uma endopoligalacturonase por inserção de diferentes CBMs (Carbohydrate Binding Modules): quimerogênese e efeito de proximidade
Palavras-chave em português
Bioenergia
Efeito de proximidade
Endopoligalacturonase
Módulos de ligação a carboidratos
Quimerogêneses
Resumo em português
O grande excedente de biomassa proveniente da agroindústria pode ser aproveitado para a produção de bioprodutos com alto valor agregado. Entre as estratégias para melhorar o aproveitamento e reduzir os custos relacionados com a hidrólise enzimática destes resíduos lignocelulósicos incluem-se a identificação e expressão heteróloga de enzimas com propriedades catalíticas interessantes, a utilização de técnicas de engenharia de proteínas, para melhorar as características das enzimas já identificadas e por fim, a formulação de coquetéis enzimáticos mais eficientes. A desconstrução precisa desta matriz lignocelulósica é bastante desafiadora e constitui uma barreira importante para alcançar uma produção razoável de bioprodutos a preços atraentes. Neste sentido, é conhecido que a presença de pectinas, um dos principais componentes da lamela média nas plantas, dificulta a hidrólise da parede celular vegetal e impede a liberação eficiente de açúcares, sendo então, necessário o desenvolvimento de tecnologias visando otimizar a hidrólise deste polissacarídeo. O presente trabalho visou avaliar as propriedades bioquímicas e cinéticas de uma endopoligalacturonase de Chondrostereum purpureum (EndoPGCp) expressa em Pichia pastoris e em Escherichia coli, bem como avaliar o efeito da imobilização sobre a atividade da enzima. Além disso, foi proposto o uso da quimerogênese para avaliar o efeito da proximidade de diferentes polissacarídeos presentes na parede celular vegetal sobre a atividade de uma EndoPGCp_bac, engenheirada pela adição de um módulo de ligação a carboidrato (CBM), bem como o potencial de aplicação na suplementação de um coquetel enzimático comercial para hidrólise de diferentes resíduos lignocelulósicos. A enzima expressa em P. pastoris apresentou uma massa molecular de cerca de 60,0 kDa, com um teor estimado de carboidratos de 67,0% (m/m). A temperatura ótima e o pH da catálise foram 60 - 70 °C e pH de 4,5, respectivamente. A enzima foi altamente estável em pH 6,0 - 8,0 e reteve cerca de 60% de sua atividade inicial após incubação a 70 °C por 30 min. A enzima hidrolisou pectina cítrica com Vmax e KM de 4947,10 ± 393,63 U.mg-1 e 2,45 ± 0,23 mg.mL-1, respectivamente, e apresentou eficiência catalítica de 2052,90 ± 193,54 mL.mg-1 s-1. Além disso, a enzima foi eficiente na clarificação de sucos de maçã e maracujá. Após a imobilização em nanopartículas ferromagnéticas, a enzima não apresentou alterações significativas em suas características bioquímicas e cinéticas e manteve cerca de 65% da atividade inicial após 7 ciclos de reuso. Na suplementação do coquetel comercial Celluclast, a EndoPGCp_Pp aumentou em 1,8 vezes a liberação de açúcares redutores de resíduos de laranja. Além disso, as enzimas expressas em E. coli foram reenoveladas a partir dos corpos de inclusão e processo de quimerogênese com os CBMs não afetou as propriedades da enzima. As enzimas hidrolisaram a pectina cítrica com Vmax e KM muito semelhantes. No entanto, significante aumento foi observado no kcat, uma vez que as quimeras 3N, 44N e 77N apresentaram valores 1,4, 1,6 e 1,3, vezes maiores, respectivamente, que o obtido para o domínio catalítico isolado. Como resultado, a eficiência catalítica (kcat/KM) para a hidrólise da pectina de citros foi cerca de 60, 75 e 30% maior para as quimeras 3N, 44N e 77N, respectivamente, em comparação ao obtido para a EndoPGCp_bac. Quando aplicadas na suplementação de um coquetel comercial para hidrólise de resíduos lignocelulósicos, os resultados indicaram que as pectinases podem melhor a eficiência da sacarificação da biomassa pela remoção da pectina que impedem a ação de outras enzimas. Além disso, a maior eficiência na hidrólise das enzimas quiméricas pode estar relacionada à ação dos CBMs, que podem aumentar muito a concentração da enzima nas proximidades do substrato, levando ao aumento na hidrólise da pectina e, consequentemente, diminuem a recalcitrância da parede celular vegetal à hidrólise enzimática.
Título em inglês
Engineering of an endopolygalacturonase by insertion of different Carbohydrate Binding Modules (CBMs): Chimerogenesis and proximity effects
Palavras-chave em inglês
Bioenergy
Carbohydrate binding modules
Chimerogenesis
Endopolygalacturonase
Proximity effect
Resumo em inglês
The large biomass surplus from agribusiness activity can be used to produce bio-products with high added value. Strategies to improve utilization and reduce costs related to the enzymatic hydrolysis of these lignocellulosic residues include the identification and heterologous expression of enzymes with interesting catalytic properties, the use of protein engineering techniques, to improve the characteristics of the enzymes already identified and finally, the formulation of more efficient enzyme cocktails. The controlled deconstruction of the lignocellulosic matrix is technically challenging and constitutes major barrier for a reasonable production of bioproducts at attractive prices. It is known that the presence of pectins, one of the main components of the medium lamella in plants, hinders the hydrolysis of the plant cell wall and prevents the efficient release of sugars, so it is necessary to develop technologies to optimize the hydrolysis of this polysaccharide. The present work aimed to evaluate the biochemical and kinetic properties of an endopolygalacturonase from Chondrostereum purpureum (EndoPGCp) expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli, as well as to evaluate the effect of immobilization on the activity of the enzyme. In addition, the use of chimerogenesis was proposed to evaluate the effect of the proximity of different polysaccharides present in the plant cell wall on the activity of an EndoPGCp_bac, engineered by the addition of carbohydrate binding modules (CBM), as well as the potential for application in the supplementation of a commercial enzymatic cocktail for hydrolysis of different lignocellulosic residues. The enzyme expressed in P. pastoris had a molecular mass of about 60.0 kDa, with an estimated carbohydrate content of 67.0% (w/w). The optimum temperature and pH of the catalysis were 60 - 70 ° C and pH 4.5, respectively. The enzyme was highly stable at pH 6.0 - 8.0 and retained about 60% of its initial activity after incubation at 70 ° C for 30 min. The enzyme hydrolyzed citric pectin with Vmax and KM of 4947.10 ± 393.63 U.mg-1 and 2.45 ± 0.23 mg.mL-1, respectively, and presented catalytic efficiency of 2052.90 ± 193.54 mL.mg-1.s-1. In addition, the enzyme was effective in clarifying apple and passion fruit juices. After immobilization on ferromagnetic nanoparticles, the enzyme showed no significant changes in its biochemical and kinetic characteristics and maintained approximately 65% of the initial activity after 7 cycles of reuse. In supplementing the commercial cocktail Celluclast, EndoPGCp_Pp increased the release of sugars reducing of orange residue by 1.8 times. In addition, the enzyme expressed in E. coli was refolded from the inclusion bodies and the process of chimerogenesis with CBMs did not affect the properties of the enzyme. The enzymes hydrolyzed the citrus pectin with very similar Vmax and KM. However, a large increase was observed in the kcat, since the chimeras 3N, 44N and 77N showed values 1.4, 1.6 and 1.3, times higher, respectively, than that obtained for the isolated catalytic domain. As a result, the catalytic efficiency (kcat/KM) for the hydrolysis of citrus pectin was about 60, 75 and 30% higher for chimeras 3N, 44N and 77N, respectively, compared to that obtained for EndoPGCp_bac. When applied in the supplementation of a commercial cocktail for hydrolysis of lignocellulosic residues, the results indicated that pectinases can improve the efficiency of the biomass saccharification by removing the pectin that prevent the action of other enzymes. In addition, the improved hydrolytic efficiency by chimeric enzymes may be related to the action of CBMs, which can greatly increase the concentration of the enzyme in the vicinity of the substrate, leading to an increase in pectin hydrolysis and, consequently, a decrease in the recalcitrance of the plant cell wall to enzyme hydrolysis.
 
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Data de Liberação
2023-02-09
Data de Publicação
2021-03-23
 
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