Ossificação endocondral é mediada pelas vesículas da matriz (MV), uma classe especial de vesículas extracelulares responsáveis por iniciar a precipitação de fosfato de cálcio. Essas vesículas são enriquecidas por duas enzimas principais: (a) fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP), possuindo atividade fosfomonohidrolítica, produzindo fosfato inorgânico (Pi) pela hidrólise de adenosina-5'-trifosfato (ATP) e de pirofosfato (PPi); e (b) ectonucleotideo pirofosfatase/fosfodiesterase 1 (NPP1), uma ATP fosfodiesterase, produzindo adenosina-5'-monofosfato (AMP) e PPi. Nesse estudo investigamos a cinética do ATP usando lipossomos incorporados com NPP1 e TNAP como modelos biomiméticos das MV e os efeitos da combinação de ambas enzimas na mineralização in vitro. A NPP1 foi solubilizada com sucesso, resultando em alta porcentagem de recuperação proteica e atividade enzimática. Em seguida, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), esfingomielina (SM) e colesterol (Chol) foram utilizados na composição lipídica dos lipossomos. Nesses lipossomos, foi incorporada a NPP1 e posteriormente caracterizados por Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Potencial Zeta e Microscopia de Força Atômica (AFM). Estudos anteriores com TNAP-proteolipossomos constituídos apenas por DPPC mostraram um grande potencial de propagação mineral. O mesmo foi observado nos NPP1-proteolipossomos. Assim, esta composição foi utilizada para incorporação de NPP1 e TNAP simultaneamente em proporções proteicas de 1:1, 1:10 e 10:1, estudando o comportamento cinético de ambas enzimas ao longo do processo de biomineralização utilizando ATP, resultando em dados inéditos. As cinéticas dos proteolipossomos foram obtidas por quantificação empregando-se Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) de adenosina-5'-difosfato (ADP) e AMP como produtos da hidrolise de ATP. As proporções de 10:1 e 1:10 de NPP1 para TNAP resultaram na queda da atividade catalítica. De outra forma, na proporção 1:1 a atividade enzimática geral aumentou. A presença do inibidor específico da NPP1 (suramina) resultou em um declínio significativo na atividade enzimática para todas as proporções. Além disso, esse efeito foi mais acentuado em NPP1-proteolipossomos, destacando a seletividade da suramina. Todos os ensaios de mineralização in vitro usando proteolipossomos mostraram propagação mineral. NPP1-proteolipossomos mostraram dois estágios na curva de mineralização, o segundo estágio é semelhante a toda curva obtida para TNAP-proteolipossomos, devido a mudança na atividade da NPP1, de fosfodiesterase para fosfomonohidrolase. Os minerais formados no ensaio de mineralização foram secos e analisados por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier - Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR). Os espectros revelaram um aumento na correlação fosfato/carbonila (PO4^3-/C=O). Da mesma forma, analisando as bandas de FTIR-ATR para TNAP- e NPP1:TNAP-proteolipossomos (diferentes proporções), observou-se a presença de hidroxiapatita (HAp) derivada do octacálcio fosfato (OCP), enquanto para NPP1-proteolipossomos uma pequena porção de pirofosfato de cálcio dihidratado (CPPD), bem como HAp derivada de OCP foi observada. Assim, lipossomos contendo ambas as enzimas foram uma maneira efitiva de estudar passo a passo a mineralização mediada pela atividade enzimática, reforçando a tese de que os sistemas miméticos são uma notável metodologia para entender as vias que levam a formação/inibição de minerais nas MV.

Endochondral ossification is mediated by matrix vesicles (MV) - a special class of extracellular vesicles responsible for the initial precipitation of calcium phosphates. These vesicles are enriched in two main enzymes: (a) tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP), that has phosphomonohydrolytic activity and produces inorganic phosphate (Pi) from adenosine-5'-triphosphate (ATP) and inorganic pyrophosphate (PPi); (b) and ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (NPP1), an ATP phosphodiesterase, producing adenosine-5'-monophosphate (AMP) and PPi. In this study, we investigated the ATP kinetics using liposomes harboring TNAP and NPP1 as MV-biomimetic models, and the effects of the combination the enzymes on in vitro biomineralization. The NPP1 was successfully solubilized, yielding high percentage of protein recovery and enzymatic activity. Sequentially, dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), sphingomyelin (SM) and cholesterol (Chol) were used as lipid composition to liposomes. Into the liposomes, the NPP1 was incorporated and further characterized by Dynamic Light Scattering (DLS), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Zeta potential and Atomic Force Microscopy (AFM). Previous studies of TNAP-proteoliposomes constituted only by DPPC had shown a great potential for mineral propagation. The same was observed for NPP1-proteoliposomes. Thus, this lipid composition was used for the incorporation of NPP1 and TNAP simultaneously in the protein ratios of 1:1, 10:1 and 1:10, therefore resulting in the study of the kinetic behavior of both enzymes over the biomineralization process using ATP, unprecedented data in the literature. The kinects of the proteoliposomes were obtained by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) quantification of adenosine-5'-diphosphate (ADP) and AMP as the products of ATP hydrolysis. The ratios of 1:10 and 10:1 of NPP1 to TNAP resulted in a drop of the catalytic activity. Otherwise, at the 1:1 ration the overall enzymatic activity increased. The presence of the NPP1 specific inhibitor (suramin) resulted in a significant decline in enzymatic activity for all ratios. Moreover, the effect was accentuated for NPP1-proteoliposomes, highlighting the suramin selectivity. All in vitro mineralization assays using proteoliposomes showed mineral propagation. NPP1-proteoliposomes showed two stages of the mineralization curve, the second stage is similar to the whole TNAP-proteoliposomes curve because of the shift of NPP1 activity from the phosphodiesterase to phosphomohydrolase. The minerals formed in the mineralization assay were dried and analyzed by Attenuated Total Reflectance - Fourier Transform Infrared Spectroscopy - (ATR-FTIR). The spectra revealed an increase in the phosphate/carbonyl correlation (PO43-/C=O). Likewise, analyzing ATR-FTIR bands for TNAP- and NPP1:TNAP (different ratios)-proteoliposomes, it was observed the hydroxyapatite (HAp) derived from octacalcium phosphate (OCP) presence, while for NPP1-proteoliposomes a small portion of calcium pyrophosphate dihydrate (CPPD), as well as HAp derived from OCP was observed. Thus, liposomes containing both enzymes were an effective way to study step-by-step mineralization mediated by enzymatic activity, reinforcing the thesis that mimetic systems are a remarkable methodology to understand the pathways that lead to mineral formation/inhibition in MV.