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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.59.2011.tde-06102020-121432
Document
Author
Full name
Elise Marques Freire Cunha
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2011
Supervisor
Committee
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de (President)
Murakami, Mario Tyago
Ward, Richard John
Title in Portuguese
Mutações sítio-dirigidas nas regiões do sítio-ativo e da interface oligomérica do fator inibitório da migração dos macrófagos de Leishmania major (LmMIF2)
Keywords in Portuguese
Fator inibitório da migração de macrófagos
Leishmania major
Mutagênese sítio-dirigida
Abstract in Portuguese
O fator inibitório da migração de macrófagos (MIF) é considerado um importante fator no controle de infecções causadas por patógenos. Essa proteína foi encontrada primeiramente em mamíferos, mas verificou-se a presença de ortólogas em patógenos, sendo sugerida uma função moduladora do sistema imunológico do hospedeiro. A caracterização estrutural e funcional da proteína MIF em Leishmania major pode contribuir para o entendimento das funções dessa proteína na relação parasita/hopedeiro. Este trabalho teve como objetivo realizar mutações sítio-dirigidas da sequência codificadora do fator inibitório da migração de macrófagos de Leishmania major (LmMIF2) e investigar o efeito dessas mutações na manutenção da estrutura e na função dessa proteína. A mutagênese sítio-dirigida foi realizada em 3 etapas de reações de PCR, os fragmentos obtidos foram purificados, seqüenciados e clonados em vetor pET21b usando as enzimas de restrição NdeI e HindIII. A LmMIF2 recombinante (rLmMIF2) e os mutantes P2G, K34E, W66L, W108F e Δ104-113, todos eles contendo uma cauda de histidina, foram eficientemente expressos na forma solúvel em E. coli e foram purificados do lisado celular por cromatografia de afinidade. O gel de SDSPAGE mostrou uma banda única em 14.5kDa e análises de filtração em gel mostraram que, em solução, o rLmMIF2 e os mutantes apresentaram-se como dímeros. Experimentos de dicroísmo circular (CD) e de emissão de fluorescência intrínseca de triptofanos (IFTE) foram realizados para acompanhar as mudanças na estrutura secundária e terciária dessas proteínas na variação de pH do ambiente. Análises de CD UV-distante e UV-próximo mostraram que a mutação de apenas um aminoácido pode influenciar na estrutura secundária e terciária da rLmMIF2 e que as mutações não alteraram a formação de estado de glóbulo fundido em baixos pHs. Os experimentos de IFTE mostraram que há um efeito de supressão intrínseca de fluorescência que foi abolido com a substituição do triptofano da posição 108. O mutante W66L mostrou uma intensidade de fluorescência 60% menor enquanto o mutante W108F apresentou uma intensidade 25% maior do que a rLmMIF2. Ensaios de inibição da migração de macrófagos mostraram que o mutante P2G apresentou atividade de inibição da migração similar à rLmMIF2, enquanto os outros mutantes apresentaram uma atividade diminuída em cerca de 50%. Estes resultados contribuem para elucidar o papel de regiões da LmMIF2 envolvidas na manutenção da estrutura e em mudanças conformacionais da proteína, que podem estar envolvidas na atividade de modulação da resposta imune do hospedeiro.
Title in English
Site-directed mutations in the regions of the active site and the interface oligomeric analysis of the Macrophage Migration Inhibitory Factor of Leishmania major (LmMIF2)
Keywords in English
Leishmania major
Macrophage migration inhibitory factor
Site direct mutagenesis
Abstract in English
The macrophage migration inhibitory factor (MIF) is considered an important factor in the control of infections caused by pathogens. This protein was first identified in mammals but orthologues have also been found in pathogens and it has been suggested that the protein a modulates the function of the host immune system. The structural and functional characterization from the MIF of Leishmania major may therefore contribute to the understanding of the function of this protein in the host/parasite relationship. This study aimed to use site-directed mutagenesis in the macrophage migration inhibitory factor of L. major (LmMIF2) to investigate the protein structure and function. Site-directed mutagenesis was performed by PCR and the mutants were cloned into the pET21b vector using NdeI/HindIII restriction sites. The recombinant LmMIF2 (rLmMIF2) and P2G, K34E, W66L, W108F and Δ104-113 mutants, all containing a His6-tag, were efficiently expressed in soluble form in E. coli and, subsequently purified from cell lysate by affinity chromatography. A single protein band of 14.5kDa was observed in SDS-PAGE, and gel filtration analysis showed rLmMIF and mutants to be dimeric proteins. Circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence emission of tryptophan (IFTE) were performed to monitor pH-dependent changes in secondary and tertiary structure of these proteins. Far-UV and near-UV-CD analysis showed that the exchange of one amino acid can influence the secondary and tertiary structures of rLmMIF2 and that the mutations did not change the molten globule state formation at low pH. IFTE experiments showed that there is an intrinsic fluorescence quenching that is abolished by the W108 substitution. Compared with the rLmMIF2, the W66L mutant showed a decrease in fluorescence intensity of about 60%, whereas the W108F mutant presented a fluorescence increase of about 25%. Macrophage migration inhibition tests showed that the P2G mutant presented a similar inhibitory activity to the rLmMIF2, while the other mutants showed a decrease in activity of about 50%. These results contribute to elucidate the role of the regions involved in maintaining LmMIF2 structure and its conformational changes, which may be involved in the host immune response modulation.
 
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Publishing Date
2020-11-20
 
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