Extratos naturais são matrizes complexas, constituídos de várias substâncias com atividades biológicas diversas, dentre as quais algumas podem ser utilizadas como inibidores enzimáticos. Inibidores enzimáticos têm sido amplamente utilizados no tratamento de diversas doenças, como por exemplo a doença de Alzheimer (DA), que utiliza a inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE) para o resgate da função colinérgica em portadores da DA. Os métodos clássicos de fracionamento bioguiado de extratos naturais envolvem alto consumo de tempo, e triagens off-line de extratos brutos não resultam em informações sobre os compostos individuais presentes no extrato. Como alternativa surge o acoplamento de técnicas de separação cromatográfica com os ensaios biológicos. Neste contexto, com a perspectiva de desenvolver um sistema eficiente de ensaios para triagem de ligantes, foi otimizado um sistema on-flow abrangente com duas dimensões (2D-LC/MS), sendo a primeira dimensão constituída de uma coluna cromatográfica de HPLC, e a segunda dimensão composta pelo biorreator, também chamado de cIMER (capillary immobilized enzyme reactor), para o ensaio de ligantes. A detecção dos compostos separados pela fase cromatográfica e a análise da capacidade inibitória das frações dos extratos é realizada por meio do monitoramento do produto da reação enzimática após ensaio biológico por meio de espectrometria de massas (MS). No presente trabalho, o sistema 2D-LC/MS foi aplicado, comprovando sua eficiência na análise da atividade inibitória para a enzima AChE de inibidores padrão e também do extrato bruto da espécie Hippeastrum calyptratum (Amaryllidaceae), sem purificações prévias. Foi possível identificar de modo on-flow qual fração do extrato apresentava atividade inibitória e então se aprofundar no estudo dessa fração, que indica que a inibição da AChE se dá pela presença do íon de m/z 266 e/ou m/z 360 encontrados no extrato, os quais ainda não foram completamente caracterizados, porém que resulta em uma imensa diminuição das possibilidades de compostos presentes nesse extrato responsáveis pela atividade inibitória detectada que, de outra forma, não seria capaz de se esmiuçar sem fracionamento e purificação prévias do extrato.

Natural extracts are complex matrices, consisting of several substances with different biological activities, among which some can be used as enzyme inhibitors. Enzyme inhibitors have been widely used in the treatment of several diseases, such as Alzheimer's disease (AD), which uses the inhibition of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) to restore cholinergic function in AD patients. Classical methods of bioguided fractionation of natural extracts are time consuming, and off-line screenings of raw extracts do not result in information about the individual compounds present in the extract. As an alternative, there is the coupling of chromatographic separation techniques with biological assays. In this context, with the perspective of developing an efficient assay system for screening ligands, a comprehensive on-flow system with two dimensions was optimized, with the first dimension consisting of an HPLC chromatographic column, and the second dimension comprises the bioreactor, also called cIMER (capillary immobilized enzyme reactor), for the ligand assay. The detection of the compounds separated by the chromatographic phase and the analysis of the inhibitory capacity of the fractions of the extracts is performed by monitoring the enzymatic reaction product after biological assay by mass spectrometry (MS). In the present work, the 2D-LC/MS system was applied, proving its efficiency in the analysis of the inhibitory activity for AChE of standard inhibitors and also crude extract of the species Hippeastrum calyptratum (Amaryllidaceae), without previous purifications. It was possible to identify, in an on-flow way, which fraction of the extract had inhibitory activity and then to deepen the study of this fraction, which indicates that the inhibition of AChE is due to the presence of the ion of m/z 266 and/or m/z 360 found in the extract, which have not yet been totally characterized, but which results in an immense decrease in the possibilities of compounds present in this extract responsible for the inhibitory activity detected that, otherwise, would not be able to be analyzed without prior fractionation and purification of the extract.