O Fator Inibitório da Migração dos Macrófagos (MIF) é uma importante proteína pró-inflamatória e imunoreguladora que contribui para a patogenicidade de várias doenças, havendo uma correlação entre os níveis de MIF e a severidade dessas patologias. Ortólogos do MIF foram descritos em diversas espécies patogênicas ao homem, sugerindo que a produção desses ortólogos, por parasitas, tenha a função de modular a resposta imune, promovendo a sobrevivência dos parasitas no hospedeiro. O mapeamento do genoma de L. major revelou dois lócus gênicos (MIF1 e MIF2) que apresentaram uma significativa identidade com a MIF de mamíferos. Dessa forma, a caracterização estrutural e funcional de MIF2 de L. major pode contribuir para elucidar os aspectos envolvidos no mecanismo adotado pela Leishmania para evadir do sistema imune do hospedeiro, uma vez que já foi sugerido uma modulação do sistema imunológico do hospedeiros por outros parasitos que expressam MIF durante seu ciclo de vida. Neste trabalho, foi realizada caracterização estrutural em solução da MIF2 de L. major e de mutantes com deleções de 05 e 10 aminoácidos na cauda C-terminal. MIF2 de L. major e os mutantes W108F-Δ5, W66L-Δ5 e MIF2-Δ10 foram expressas em E. coli, purificadas do extrato solúvel por cromatografia de afinidade e detectada por SEC-MALS como trímero em solução (pH 7 e 4). As análises de CD UV-distante mostram que as deleções na cauda C-terminal não ocasionaram alterações na estrutura secundária em relação à MIF2 e que as proteínas mantém sua estrutura secundária estável até extremos de pH, sugerindo comportamento de glóbulo fundido. Com relação à estrutura terciária, CD de UV-próximo em pH 7 mostra que a deleção na cauda C-terminal da MIF2 ocasionou alterações no microambiente do triptofano. Esses dados foram confirmados pelas análises de fluorescência que mostraram que W108F-Δ5, W66L-Δ5 e MIF2-Δ10 apresentaram deslocamento de λmáximo para a região do vermelho, indicando ambiente mais polar para este aminoácido. É possível observar para os mutantes W108F-Δ5 e MIF2-Δ10 uma intensidade de fluorescência semelhante a da MIF2. O mutante W66L-Δ5 apresentou uma intensidade de fluorescência cerca de 50% menor do que a MIF2 recombinante evidenciando maior contribuição do W108 para a fluorescência da proteína. Espectros de fluorescência do ANS reforçam os resultados a respeito da existência de um estado de glóbulo fundido, uma vez que, tanto MIF quanto mutantes, apresentaram mudanças na estrutura terciária em pHs mais ácidos (< 4,0). Os experimentos de Dicroísmo Circular utilizando concentrações de GdnHCl (0 - 6M) demonstram que a mutação de 10 aminoácidos na cauda C-terminal diminui a estabilidade da proteína. Os mutantes com 5 aminoácidos deletados na cauda C-terminal possuem estabilidade similar à MIF2 recombinante. Ensaios de migração de macrófagos in vitro mostraram que as deleções na cauda C-terminal não influenciaram na atividade das proteínas, mostrando que esta região não é essencial para a atividade de MIF2. O nocaute gênico de MIF2 e MIFs foi obtido por CRISPR/Cas9. As cepas reexpressoras de MIF2 e mutantes MIF2Δ5 e MIF2Δ10 apresentaram crescimento similar à linhagem L. major Friedlin Cas9/T7 e da linhagem parental com o vetor pX63NEO vazio, mostrando que a reinserção de MIF2 e MIF mutada, mesmo que epissomal, restabeleceu a capacidade de replicarse em cultura. O superexpressor de MIF2 epissomal teve sua virulência diminuída quando comparada a linhagem parental pX63NEO vazio e a expressão dos mutantes MIF2Δ5 e MIF2Δ10 epissomal reverteram esse efeito. Os parasitas nocauteados de MIF2 e MIFs afetaram o crescimento do parasito em cultura e diminuíram cerca de 70% da virulência durante a infecção in vitro e in vivo e a região Cterminal está envolvida na modulação desta virulência.

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is an important pro-inflammatory and immunoregulatory protein that contributes to the pathogenicity of several diseases, with a correlation between MIF levels and the severity of these pathologies. MIF orthologues were described in several pathogenic species to human, suggesting that its production by parasites is related with immune response modulation, promoting parasite survival. The elucidation of the Leishmania major genome revealed two genes that exhibit significant sequence identity with MIF. Thus, the structural and functional characterization of L. major MIF2 may contribute to elucidate the aspects involved in the mechanism adopted by Leishmania to evade the host immune system, since it has been suggested modulation of host immune systems by other parasites which express MIF during its life cycle. In this work, structural characterization of MIF2 mutants with single tryptophan and Δ5 and Δ10 C-terminal deletions was performed. L. major MIF2 and W108F-Δ5, W66L-Δ5, MIF2-Δ10 mutants were expressed in E. coli and purified from the soluble extract by affinity chromatography and detected by SEC-MALS as a trimer in solution (pH 7 and 4). Far UV CD analyzes show that C-terminal deletion did not cause changes in secondary structure related to MIF2 and that the proteins maintain their secondary structure stable until pH 3, suggesting molten globule state. Regarding the tertiary structure, Near UV CD at pH 7 shows that MIF2 C-terminal deletions caused changes in tryptophan microenvironment. These data were confirmed by fluorescence analyzes that showed λmaximum red shift for W108F-Δ5, W66L-Δ5 and MIF2-Δ10, indicating a more polar environment for this amino acid. W108FΔ5 and MIF2-Δ10 showed fluorescence intensity similar to MIF2. W66L-Δ5 showed fluorescence intensity about 50% lower than the recombinant MIF2, evidentiating a greater contribution of W108 to the fluorescence of the protein. ANS fluorescence spectra reinforce the results regarding the existence of a molten globule state, since both MIF and mutants present changes in the tertiary structure in more acidic pHs (<4.0). Circular Dichroism experiments using concentrations of GdnHCl (0-6M) demonstrate that the Δ10 C-terminal decreases the protein stability. C-terminal Δ5 mutants have similar stability to recombinant MIF2 while the C-terminal Δ10 is more unstable. In vitro, macrophage migration assays showed that C-terminal deletions did not influence protein activity, showing that this region is not essential for MIF2 activity. Genetic knockout of MIF2 and MIFs were obtained using CRISPR/Cas9. MIF2, MIF2Δ5 and MIF2Δ10 add back strains showed similar growth curve to L. major Friedlin Cas9/T7 and parental lineage with pX63NEO vector, showing that episomal reinsertion of mutated MIF2 and mutant MIF2, reestablished the ability to replicate in culture. Episomal MIF2 overexpressor had decreased virulence increased when compared to pX63NEO vector overexpressor and MIFΔ5 and MIF2Δ10 mutants reserved thie effect. KOMIF2 and KOMIFs affected growth of the parasite in culture and decrease about 70% of virulence during in vitro and in vivo infection and the C-terminal region is envolved in the modulation of this virulence.