As proteínas TMEDs são proteínas transmembranares presentes em eucariotos em todos os subcompartimentos da via secretora inicial, ou seja, o retículo endoplasmático (RE), o Golgi e o compartimento intermediário. Embora essenciais durante o transporte bidirecional entre o RE e o Golgi, as TMEDs ainda carecem de informações sobre sua estrutura, estado oligomérico e de suas interações com a carga de transporte. Pela primeira vez, é descrita a expressão heteróloga, a caracterização biofísica e a estrutura tridimensional em alta resolução do domínio GOLD da proteína TMED 1 humana. A proteína recombinante foi purificada em duas etapas cromatográficas, apresentando rendimento e pureza que permitiram os estudos biofísicos. A análise dos dados de dicroísmo circular (CD) mostrou que, após a purificação, a proteína se encontrava enovelada e que a sua estrutura secundária era predominantemente de folhas β (~44%). A desnaturação química da estrutura secundária foi monitorada por CD na região do ultravioleta distante. A proteína apresentou-se quimicamente estável, e a curva de desnaturação segue um perfil do tipo sigmoidal (cooperativo) com uma concentração de meia transição de aproximadamente 2,8 M de uréia. A espectroscopia de fluorescência intrínseca das tirosinas foi também utilizada para avaliar a estabilidade na presença de ureia, resultando em uma transição que ocorreu em torno de 1,2 M. Do ponto de vista da estabilidade térmica, a proteína se apresentou com elevada estabilidade com temperatura de meio da transição de cerca de 60°C e não segue um modelo de transição dois estados, indicando uma provável dissociação de dímero em monômeros em estruturas desenoveladas. Os dados de Fluorimetria diferencial de varredura (DSF) mostraram que a força iônica é importante para a estabilidade estrutural do domínio GOLD. A proteína foi cristalizada com sucesso e sua estrutura determinada em uma resolução de 1,7 Å. A estrutura 3D mostrou uma organização estrutural tradicional dos domínios TMED GOLD, formado por um sanduíche-β composto por duas folhas β antiparalelas de quatro fitas conectadas por uma ligação dissulfeto. A curvatura dessas folhas-β define visualmente dois diferentes "lados" na organização conformacional, denominados côncavo (formada por β2, β7, β4 e β5) e convexo (formados por β6, β3, β8 e β1). Usamos a estrutura para realizar simulações de dinâmica molecular e o dímero apresentou-se energeticamente favorável e estável durante o tempo de simulação. A dimerização se apresentou favorecida por ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e interações π-π. Os estudos para avaliar a formação de oligômeros em relação à concentração e à força iônica sugerem que a formação dos dímeros depende de ambos os fatores. Neste trabalho, propomos um modelo de ancoragem do dímero à membrana baseado na carga eletrostática superficial da proteína. Em tal modelo, o dímero se mostra orientado com seu lado convexo para o citosol, o que está de acordo com o modelo in vivo proposto em outros trabalhos e que permitiria a interação com o receptor ST2. O fato das membranas do complexo de Golgi e do RE serem enriquecidas em lipídeos carregados negativamente confere potencial impacto funcional à orientação proposta para o dímero.

TMED proteins are eukaryotic transmembrane proteins present in all subcompartments of the early secretory pathway, i.e. the endoplasmic reticulum (ER), Golgi and the intermediate compartments. Although essential in the bidirectional protein transport between the ER and Golgi, TMEDs still lack information about their structure, oligomeric state and their interactions with the transport cargo. For the first time, the heterologous expression, biophysical characterization and the high-resolution structure of the human TMED1 GOLD domain are described. The recombinant protein was purified in two chromatographic steps, presenting a satisfactory yield and purity for the biophysical studies. The analysis of the circular dichroism data (CD) showed that, after purification, the protein was folded and that its secondary structure is predominantly composed of β-strands (~44%). The chemical denaturation of its secondary structures was monitored by CD in the region of the far ultraviolet. The protein was chemically stable, and the denaturation curve followed a sigmoid-like profile (cooperative) with a concentration of half transition of approximately 2.8 M urea. Tyrosine intrinsic fluorescence spectroscopy was also used to assess the stability in the presence of urea, resulting in a transition occurring at ca. 1.2 M. The protein presented high thermal stability with a melting temperature of about 60 °C and following a transition model of non-two-states, which indicated a probable dissociation of dimer to monomers to unfolded structures. DSF data showed that the ionic-strength was important for the structural stability of the GOLD domain. The protein was successfully crystallized, and its structure determined at a resolution of 1.7 Å. The 3D structure showed the traditional arrangement of the TMED GOLD domains, with a structural organization of a β-sandwich fold composed of two four-strand antiparallel β-sheets connected by a disulphide bond. The curvature of the molecule defines visually two different "sides" in this conformational organization called concave (formed by β2, β7, β4, and β5) and convex sides (formed by β6, β3, β8, and β1). We used the high-resolution structural model of the TMED1 GOLD dimer to perform molecular dynamic simulations, which showed that the dimer was energetically favorable and stable during the simulation time. Dimerization was favored by hydrogen bonds, hydrophobic interactions and π-π interactions. Studies to evaluate the formation of oligomers as a function of the concentration and ionic-strength suggest that the formation of dimers depended on both factors. Here, we propose a model for the anchoring of the dimer to the membrane based on the surface electrostatic charge of the protein. In such a model, the dimer is oriented with its convex side towards the cytosol, which is in accordance with the in vivo model previously reported and that would allow interaction with the ST2 receptor. The fact that the Golgi complex and the ER membranes are enriched in negatively-charged lipids gives potential functional impact to the proposed dimer orientation.