GRASP55 is a myristoylated protein localized in the medial/trans-Golgi faces and involved in the Golgi structure maintenance and the regulation of unconventional secretion pathways. It is believed that GRASP55 achieves its main functionalities in the Golgi organization by acting as a tethering factor and, when bound to the lipid bilayer, its orientation relative to the membrane surface is restricted to determine its proper trans-oligomerization. Despite the paramount role of myristoylation in GRASP function, the impact of such protein modification on the membrane-anchoring properties and the structural organization of GRASP remains elusive. Here, an optimized protocol for the myristoylation in E. coli of the membrane-anchoring domain of GRASP55 is presented. The biophysical properties of the myristoylated/non-myristoylated GRASP55 (residues 1-207) were characterized in a membrane-mimicking micellar environment. Although myristoylation did not cause any impact on the protein's secondary structure, according to our circular dichroism data, it had a significant impact on the protein's thermal stability and solubility. Electrophoresis of negatively charged liposomes incubated with the two GRASP55 constructions showed different electrophoretic mobility for the myristoylated anchored protein only, thus demonstrating that myristoylation is essential for the biological membrane anchoring. Molecular dynamics simulations were used to further explore the anchoring process in determining the restricted orientation of GRASPs in the membrane.

GRASP55 é uma proteína miristoilada localizada nas faces medial/trans do Golgi, e com envolvimento na manutenção da estrutura do Golgi, bem como na regulagem de vias de secreção não-convencionais. Acredita-se que a GRASP55 realiza suas principais funções na organização do Golgi agindo como um fator de conexão, e quando ligada à bicamada lipídica, sua orientação em relação à superfície da membrana é restrita para determinar sua trans-oligomerização de maneira adequada. Apesar da importância da miristoilação na função da GRASP e no ancoramento em membranas, o impacto dessa modificação proteica nas propriedades de ancoramento e organização estrutural das GRASPs permanece elusivo. Neste trabalho, um protocolo otimizado para a miristoilação de GRASP55 em E. coli é apresentado, e os domínios de ancoramento miristoilado/não-miristoilado (resíduos 1-207) foram caracterizados através de suas propriedades biofísicas em um ambiente micelar. Apesar de a miristoilação não ter causado impactos na estrutura secundária, de acordo com os dados de dicroísmo circular, esta lipidação causou um grande impacto na estabilidade térmica e solubilidade proteica. A eletroforese de lipídeos negativamente carregados previamente incubados com as duas versões de GRASP55 apresentou uma mobilidade eletroforética diferente apenas para a proteína miristoilada, demonstrando que a miristoilação é essencial para o ancoramento em membranas biológicas. Simulações de dinâmica molecular foram utilizadas para explorar o processo de ancoramento determinação da orientação restrita das GRASPs na membrana.