GRASPs (from Golgi ReAssembly and Stacking Proteins) are proteins involved in the organization and maintenance of the Golgi complex. While the extension of this role has been questioned in the past few years, many other functions have been assigned to them. In particular, we highlight the participation in tethering vesicles that need to move along the Golgi and processes of unconventional protein secretion. Structurally, GRASPs can be divided in an N-terminal domain called GRASP and a non-conserved, highly disordered C-terminal domain, termed SPR. Structural information, hitherto, has been scarce, which motivated the beginning of this project. To study GRASPs, we used the only GRASP (called Grh1) of a model organism: the yeast Saccharomyces cereviseae. We showed that Grh1 contains regions of intrinsic disorder also in its GRASP domain, being classified as a molten globule. Besides, Grh1 is capable of forming amyloid-like fibrils when in specific conditions in vitro, such as low pH and moderately elevated temperature. With the aim of investigating a possible relationship between fibril formation and the role played by Grh1 in unconventional protein secretion, part of the present thesis was done in vivo, and it was possible to demonstrate that the yeast GRASP fibrillates in starvation and heat-shock conditions. Here, we discuss the use of Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy as a valid technique to help detect fibril formation in cell and also the possible implications of fibrillation for the formation of the Compartments for Unconventional Protein Secretion (CUPS). This work also contains initial experiments that point to a liquid-liquid phase separation of Grh1, an observation in consonance with the findings of intrinsic disorder and the recent proposition that the Golgi is actually an organelle phase separated from the cytosol. Finally, we present initial experiments of the characterization of Bug1, the golgin partner of Grh1. There are no structural data available on golgins in solution yet and their purification always presented an obstacle on obtaining them. We describe here a protocol capable of purifying Bug1 in high quantities, therefore paving the way for many other discoveries in the fields of protein secretion and liquid-liquid phase separation.

GRASPs (de Golgi ReAssembly and Stacking Proteins) são proteínas inicialmente envolvidas na organização e manutenção do complexo de Golgi. Enquanto este papel vem sendo questionado nos últimos anos, muitas outras funções vem sendo a elas atribuídas. Em especial, destacamos a participação no ancoramento de vesículas de secreção que precisam atravessar o Golgi e processos de secreção não convencional. Estruturalmente, GRASPs podem ser divididas em um domínio N-terminal chamado GRASP e um domínio C-terminal que é altamente desordenado e não conservado, chamado SPR. Informação estrutural sobre GRASPs, até agora, tem sido muito escassa, o que motivou o início deste trabalho. Para estudar GRASPs, usamos a única GRASP da levedura Saccharomyces cereviseae (Grh1), um organismo modelo. Demonstramos que Grh1 possui regiões de desordem intrínseca também no domínio GRASP, sendo considerada uma proteína do tipo molten globule. Além disso, Grh1 é capaz de formar fibras do tipo amiloide quando em condições específicas in vitro, como baixo pH e temperatura levemente elevada. No objetivo de investigar uma possível correlação entre a formação de fibras e a função desempenhada por Grh1 em processos de secreção não convencional, parte desse trabalho foi realizada in vivo, e foi possível mostrar que a GRASP de levedura fibrila em condições específicas de privação de nutrientes e choque térmico. Aqui, discutimos o uso da microscopia do tempo de vida de fluorescência como uma técnica válida para auxiliar na detecção de formação de fibras in cell, e também as possíveis implicações da formação de fibras por GRASPs para formação de Compartimentos para Secreção Não Convencional (do inglês CUPS). Esse trabalho também contém experimentos iniciais que apontam para uma separação de fase líquido-líquido sofrida poe Grh1, o que estaria em consonância com os achados de desordem intrínseca e a recente proposta de que o Golgi seria, na verdade, uma organela em fase separada do citosol. No final deste trabalho, apresentamos ainda experimentos iniciais de caracterização de Bug1, a golgina parceira de Grh1. Não existem dados estruturais disponíveis para nenhuma golgina em solução, e sua purificação sempre se mostrou um obstáculo. Descrevemos aqui um protocolo através do qual foi possível se purificar Bug1 em grandes quantidades, abrindo caminho assim para que muitas outras descobertas sejam feitas no que diz respeito à secreção de proteínas e separação de fase líquido-líquido.