A terapia cell-free utilizando o secretoma celular presente no meio condicionado (CM) por células-tronco mesenquimais (MSCs) vem sendo relatadas na literatura científica como uma estratégia terapêutica promissora no campo da medicina regenerativa com vistas ao reparo do tecido ósseo. Este secretoma consiste num conjunto de fatores e moléculas secretadas para o espaço extracelular, o qual permite a comunicação celular, a regulação biológica e a modulação das diversas condições fisiológicas teciduais. Dentre as moléculas secretadas, está a proteína óssea morfogenética 9 (BMP-9), importante componente de tecidos ósseos endocondrais e intramembranosos, relatadas como uma das mais osteoprogenitoras da família das BMPs. Partindo disso, este estudo teve como objetivo investigar o potencial do secretoma presente no CM por células MSCs editadas geneticamente para superexpressão da proteína BMP-9 (CM-MSCsBMP-9) na indução da diferenciação osteoblástica in vitro de MSCs primárias e no reparo ósseo in vivo em defeitos críticos criados na calvária de camundongos. MSCs foram obtidas da medula óssea (MO) de camundongos machos da linhagem C57BL/6 de 8 semanas da idade e passaram pelo processo de edição gênica por meio da técnica de CRISPR-Cas9, sendo que um grupo foi infectado apenas com o vetor vazio (MSCsVPR) enquanto o outro grupo recebeu a combinação da endonuclease SP-dCas9-VPR mais o RNA guia customizado para a superexpressão de BMP-9 com repórter GFP positivo (MSCsBMP-9). Após a confirmação da efetividade desse processo por meio na análise da expressão gênica de Bmp-9 pela técnica de PCR em tempo real e a marcação positiva de GFP por citometria de fluxo, essas células foram utilizadas para o obtenção dos CMs em diferentes tempos. Confirmou-se por meio de teste imunoenzimático de ELISA a presença secretada de BMP-9 nos CMs coletados, sendo que seu maior pico de expressão se deu após 1 hora de cultura sem a presença do soro fetal bovino (SFB), período de eleição do CM a ser utilizado nos experimentos seguintes. Para avaliação do efeito dos CMs sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs, as células foram crescidas em contato com o meio condicionado por MSCsVPR (CM-MSCsVPR) e por MSCsBMP-9 (CM-MSCsBMP-9) na proporção 1:1 com o meio de crescimento não indutor fresco (MEM 20%) sempre nas últimas 48 horas que antecediam o experimento a ser realizado. Avaliou-se a capacidade de migração celular pelo método scratch, a viabilidade celular por meio de ensaio colorimétrico de MTT, a expressão gênica de marcadores ósseos (Runx2, Alp e Opn) por PCR em tempo real, a expressão proteica de marcadores ósseos (RUNX2, ALP e OPN) por western blot e a atividade fenotípica de ALP in situ pelo método Fast Red. Foi perceptível o efeito positivo de CM-MSCsBMP-9 sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs, o qual foi capaz de induzir um perfil osteoblástico fenotípico in vitro. Já para a avaliação do efeito dos CMs sobre o reparo ósseo, uma semana após a criação de defeitos críticos de 4 mm criados em calotas cranianas de camundongos, fez-se o tratamento dos defeitos pela injeção de um volume de 25 µL de CM-MSCsVPR e CM-MSCsBMP-9. Quatro semanas após o tratamento, percebeu-se por meio das reconstruções tridimensionais da análise morfométrica de µCT, que o tratamento com CM-MSCsBMP-9 favoreceu a regeneração do tecido ósseo comparado aos defeitos tratados com CM-MSCsVPR e os animais que não foram submetidos a nenhum tratamento, gerando um maior volume ósseo, porcentagem de volume ósseo, superfície óssea e um maior número de trabéculas no tecido ósseo in vivo. Esses dados foram corroborados pela análise histológica, mostrando que as MSCs editadas geneticamente para superexpressão de BMP-9 foram capaz de formar um tecido ósseo com qualidade semelhante ao osso nativo, sem indicadores inflamatórios. Além disso, também observamos que o tratamento com CM-MSCsBMP-9 favoreceu a regeneração do tecido ósseo frente a defeitos tratados com MSCsBMP-9. Por fim, este estudo mostrou que o CM-MSCsBMP-9 possui alto potencial osteogênico e osteoindutor, sendo uma metodologia interessante para a aplicação clínica no campo da Odontologia e Medicina, na qual, além de suas vantagens a nível molecular para o reparo do tecido ósseo de sítios desafiadores, possui baixo custo da produção e a possibilidade da realização de uma terapia guiada para efeitos terapêuticos específicos.

Cell-free therapy using the cellular secretome present in the conditioned medium (CM) of mesenchymal stem cells (MSCs) has been reported in the scientific literature as a promising therapeutic strategy in the field of regenerative medicine with a view to repairing bone tissue. This secretome consists of a set of factors and molecules secreted into the extracellular space, which allows cell communication, biological regulation and modulation of various tissue physiological conditions. Among one of the secreted molecules is the bone morphogenetic protein 9 (BMP-9), important components of endochondral and intramembranous bone tissues, reported as one of the most osteoprogenitor of the BMPs family. Based on this, this study aimed to investigate the potential of the cellular secretome present in the CM by genetically edited MSCs cells for overexpression of the BMP-9 protein in inducing osteoblastic differentiation in vitro of primary MSCs and in vivo bone repair in critical defects created in the mouse calvarial. MSCs were obtained from the bone marrow of 8-week-old male C57BL/6 mice and underwent the gene editing process using the CRISPR-Cas9 technique, with one group infected only with the empty vector (MSCsVPR) while the other group received the combination of SP-dCas9-VPR endonuclease plus the customized guide RNA for the overexpression of BMP-9 with positive GFP reporter (MSCsBMP-9). After confirming the effectiveness of this process through the analysis of the gene expression of Bmp-9 by the PCR technique in real time and the positive labeling of GFP by flow cytometry, these cells were used to obtain the CM in different times. The secreted presence of BMP-9 in the collected CMs was confirmed by means of an ELISA immunoenzymatic test, and its highest expression peak occurred after 1 hour of culture without the presence of fetal bovine serum (FBS), the period of election of the CM to be used in the following experiments. To evaluate the effect of CMs on the osteoblastic differentiation of MSCs, the cells were grown in contact with the CM by MSCsVPR (CM-MSCsVPR) and by MSCsBMP-9 (CM-MSCsBMP-9) in the proportion 1:1 with fresh non-inducing growth medium (MEM 20%) always in the last 48 hours before the experiment to be carried out. Cell migration capacity was evaluated by the scratch method, cell viability by MTT colorimetric assay, gene expression of bone markers (Runx2, Alp and Opn) by real-time PCR, protein expression of bone markers (RUNX2, ALP and OPN) by western blot and the phenotypic activity of ALP in situ by the Fast Red method. The positive effect of CM-MSCsBMP-9 on osteoblastic differentiation of MSCs was noticeable, which was able to induce a phenotypic osteoblastic profile in vitro. As for the evaluation of the effect of CMs on bone repair, one week after the creation of critical defects of 4 mm created in the mouse calvarial, the defects were treated by injecting a volume of 25 µL of CM-MSCsVPR and CM-MSCsBMP-9. Four weeks after the treatment, it was noticed through the three-dimensional reconstructions of the morphometric analysis of µCT, that the treatment with CM-MSCsBMP-9 favored the repair of the bone tissue compared to the defects treated with CM-MSCsVPR and the animals that were not submitted to no treatment, generating a greater bone volume, percentage of bone volume, bone surface and a greater trabecular number in bone tissue in vivo. These data were corroborated by histological analysis, showing that MSCs genetically edited for BMP-9 overexpression were able to form bone tissue with similar quality to native bone, without inflammatory indicators. Furthermore, we also observed that treatment with CM-MSCsBMP-9 favored bone tissue repair in comparison of defects treated with MSCsBMP-9. Finally, this study showed that CM-MSCsBMP-9 has a high osteogenic and osteoinductive potential, being an interesting methodology for clinical application in the field of Dentistry and Medicine, in which, in addition to its advantages at the molecular level for tissue repair challenging sites, has low production cost and the possibility of carrying out a guided therapy for specific therapeutic effects.