A disponibilização de moléculas bioativas em superfícies de implantes metálicos osseointegráveis objetiva promover a formação óssea na região interfacial durante o processo de reparo, especialmente em sítios anatômicos com baixa densidade óssea. Entre os diferentes aspectos físico-químicos de superfícies de titânio (Ti), a nanotopografia obtida por H2SO4 e H2O2 (Nano-Ti) constitui-se em opção importante para esta finalidade, pelos benefícios que proporciona à formação óssea. Apesar de a proteína óssea morfogenética 7 (BMP-7) ser reconhecida como estimuladora da diferenciação osteoblástica, são ainda contraditórios os efeitos de sua disponibilização sobre a aquisição do fenótipo osteogênico em contato com Ti. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos 1) da suplementação de BMP-7 ao meio de cultura sobre parâmetros chaves de sinalização/diferenciação celulares durante a fase proliferativa de culturas de células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 e UMR-106 crescidas sobre Ti Controle e Nano-Ti (Estudo 1), e 2) da funcionalização de BMP-7 em Nano-Ti sobre a sinalização/diferenciação de células MC3T3-E1 crescidas em contato com coágulo sanguíneo ex vivo, formado previamente por implantação subcutânea de Nano-Ti em camundongos (Estudo 2). No Estudo 1, células MC3T3-E1 sobre Ti Controle e Nano-Ti apresentaram responsividades distintas à BMP-7 a 40 ng/mL e 200 ng/mL. Enquanto que efeitos osteogênicos significativos foram observados sobre Ti Controle em relação à proliferação celular, expressão de Runx2, Osx, Alp, Bsp, Opn, Smad 1 e atividade de ALP in situ, sobre Nano-Ti esses efeitos se limitavam ao aumento da expressão de Alp, Bsp, Opn e atividade de ALP in situ, majoritariamente já com 40 ng/mL de BMP-7. Essa concentração mantinha inalterado o potencial osteogênico de culturas UMR-106, enquanto que a de 200 ng/mL o reduzia. No Estudo 2, a presença do coágulo sanguíneo sobre Nano-Ti inibiu a expressão de marcadores osteoblásticos em células MC3T3-E1, com exceção para Opn, mantendo inalteradas as de Smad 1 e Smad 4. A funcionalização com BMP-7, por simples adsorção de solução a 400 ng/mL, resultou em tendência à maior diferenciação osteoblástica sobre o coágulo sanguíneo, mas em menor grau em comparação ao de culturas crescidas diretamente sobre Nano-Ti, o que foi corroborado pela quantificação de RUNX2, sem, no entanto, alterar a expressão das Smads avaliadas. Quantidades menores de OPN, SMAD 1, 5 e 9 fosforilada e SMAD 4 foram detectadas em culturas expostas à BMP-7, com exceção para OPN naquelas crescidas diretamente sobre Nano-Ti. A forma clivada de OPN e bandas de menor peso molecular reconhecidas pelos anticorpos anti-SMAD 1, 5 e 9 fosforilada e anti-SMAD 4 foram observadas apenas na presença de coágulo sanguíneo. Em conclusão, a disponibilização de BMP-7 para células MC3T3-E1 nas concentrações de 40 ng/mL e 200 ng/mL altera o perfil de expressão de marcadores osteoblásticos, indicativo da aquisição de um estágio mais avançado de diferenciação celular, com efeitos mais pronunciados para Ti Controle, entretanto sem refletir em aumento da produção de matriz mineralizada por células UMR-106. A presença de coágulo sanguíneo ex vivo sobre Nano-Ti reduz a diferenciação de células MC3T3-E1, com tendência à reversão para o estímulo à diferenciação osteoblástica com a funcionalização de BMP-7.

The availability of bioactive molecules on osseointegrable, metallic implant surfaces aims at promoting bone formation in the interfacial area during tissue repair, mainly at anatomic sites with low bone density. Among the diverse physico-chemical features of titanium (Ti) surfaces, the nanotopography created by treatment with H2SO4 and H2O2 (Nano-Ti) can be a good candidate for that purpose, as it positively impacts bone formation. Although the bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) has been shown to be stimulatory for osteoblastic differentiation, the effects of its availability on the acquisition of the osteogenic phenotype on Ti are still contradictory. The present study aimed at evaluating 1) the effects of supplementation of the culture medium with BMP-7 on key parameters of cell signalling/differentiation during the proliferative phase of preosteoblastic MC3T3-E1 and UMR-106 cell cultures grown on Control Ti and Nano-Ti (Study 1), and 2) the effects of BMP-7 functionalization on key parameters of cell signalling/differentiation of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cell cultures grown in contact with ex vivo blood clot that was previously formed on Nano-Ti by means of subcutaneous implantation in mice (Study 2). The results of the Study 1 showed that MC3T3-E1 cells grown either on Control Ti or Nano-Ti exhibited distinct responsiveness to 40 ng/mL and 200 ng/mL BMP-7. Already with the lower concentration of BMP-7, significant osteogenic effects were noticed for Control Ti group in terms of cell proliferation, Runx2, Osx, Alp, Bsp, Opn, and Smad 1 mRNA expression and in situ ALP activity, while for Nano-Ti these were limited to higher Alp, Bsp, and Opn mRNA expression and in situ ALP activity. The osteogenic potential of UMR-106 cultures was maintained inaltered with 40 ng/mL BMP-7 and was reduced when cells were exposed to the 200 ng/mL concentration. The results of the Study 2 showed that the presence of bood clot inhibited the expression of the osteoblast markers by MC3T3-E1 cells, except for Opn, while unaffecting those of Smad 1 and Smad 4. The surface functionalization of Nano-Ti, by simple adsorption using a solution of 400 ng/mL BMP-7, resulted in a tendence towards higher osteoblastic cell differentiation on blood clot, but in a lesser degree compared with that of the cultures grown directly on Nano-Ti- a finding that was corroborated by the quantification of RUNX2, while unaffecting the expression of Smads 1 and 4. Smaller quantities of OPN, phosphorylated SMAD 1, 5 and 9, and SMAD 4 were detected in cultures exposed to BMP-7, except for OPN in those grown directly on Nano-Ti. The cleaved form of OPN and bands with lower molecular weight recognized by the antibodies against phosphorylated SMAD 1, 5 and 9 and SMAD 4 were observed only in the presence of blood clot. In conclusion, the availability of BMP-7 to MC3T3-E1 cells at the concentrations used alters the expression profile of osteoblast markers, indicative of the acquisition of a more advanced stage of differentiation, more pronounced for Control Ti, but without reflecting in higher mineralized matrix production by UMR-106 cultures. The presence of an ex vivo blood clot on Nano-Ti reduces the differentiation of MC3T3-E1 cells, with a tendency to reversion towards osteoblastic differentiation with BMP-7 functionalization.