Nosso grupo de pesquisa tem avaliado células-tronco mesenquimais (MSCs) derivadas da medula óssea, do tecido adiposo e do ligamento periodontal, e MSCs diferenciadas em osteoblastos para promover o reparo ósseo, esses estudos tem mostrado significativa formação óssea em defeitos tratados com os diferentes tipos celulares utilizados quando comparados com defeitos não tratados. Embora esses resultados sejam promissores e comprovem a eficácia da terapia celular, a completa regeneração óssea ainda não foi observada, a despeito do uso de MSCs que sobre-expressam BMP-9 (MSCs^BMP-9+). Nesse contexto, é relevante avaliar se o condicionamento de MSCs^BMP-9+ por Hipóxia aumentaria seu potencial terapêutico na regeneração óssea. Nossas hipóteses são que a Hipóxia regula a expressão de componentes e alvos da via de sinalização de BMPs em MSCs^BMP-9+ e que o secretoma dessas células cultivadas sob Hipóxia aumenta a migração e diferenciação osteoblástica de MSCs e osteoblastos, as células que participam mais ativamente do processo de regeneração óssea. Inicialmente foi realizado a padronização para indução de Hipóxia onde MSCs^BMP-9+ foram tratadas com o mimetizador químico de Hipóxia cloreto de cobalto (CoCl₂) e avaliado o efeito dose-resposta e a expressão de HIF-1α e seus alvos Glu1 e Vegfa, avaliação do efeito da Hipóxia sobre os componentes e alvos da via de sinalização de BMP e os efeitos do secretoma, contido no meio condicionado de MSCs^BMP-9+ sob Hipóxia (MC Hipóxia) na viabilidade, migração celular e na diferenciação osteoblástica de MSCs e osteoblastos. Os resultados demonstraram que as concentrações maiores que 100 µM de CoCl₂ reduziram a viabilidade em todos os períodos avaliados (p<0,001). A Hipóxia induzida por 40 µM de CoCl₂ nos últimos 3 dias não afetou a viabilidade celular de MSCs^BMP-9+, resultou em maior expressão proteica de HIF-1α e 4 h após a remoção da Hipóxia ainda pode ser observado um aumento da expressão gênica de Glu1 e Vegfa quando comparada ao Controle. A Hipóxia não afetou a expressão proteica de BMP-9 e a expressão gênica de Bmp-4, Smad5 e Runx2, mas regulou positivamente a expressão gênica de Bmp- 2, Bmpr1a, Smad1 e Hey1. O MC Hipóxia não afetou a viabilidade celular de MSCs e de osteoblastos em todos os períodos avaliados, mas aumentou a migração de MSCs e de osteoblastos, bem como aumentou a diferenciação osteoblástica como revelado pela expressão das proteínas RUNX2 e ALP, sem afetar a atividade de ALP em MSCs e osteoblastos. Nossos dados indicam que à Hipóxia regula a via de sinalização de BMP em MSCs^BMP-9+ e que o MC derivado dessas células cultivadas em condições de Hipóxia aumenta a migração celular e a diferenciação osteoblástica de MSCs e osteoblastos. O uso de MC ou moléculas secretadas por MSCs sobre-expressando BMP-9 cultivadas sob Hipóxia têm potencial para aumentar a formação óssea.

Our research group has evaluated mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow, adipose tissue and periodontal ligament, and MSCs differentiated into osteoblasts to promote bone repair, and these studies have shown significant bone formation in defects treated with the different cell types used when compared with untreated defects. Although these results are promising and prove the effectiveness of cell therapy, complete bone regeneration has not yet been observed, despite the use of MSCs that overexpress BMP-9 (MSCs^BMP-9+). In this context, it is relevant to assess whether the conditioning of MSCs^BMP-9+ by Hypoxia would increase its therapeutic potential in bone regeneration. Our hypotheses are that Hypoxia regulates the expression of components and targets of the BMPs signaling pathway in MSCs^BMP-9+ and that the secretome of these cells cultured under Hypoxia increases the migration and osteoblastic differentiation of MSCs and osteoblasts, the cells that most actively participate of the bone regeneration process. Initially, the standardization for Hypoxia induction was carried out where MSCs^BMP-9+ were treated with the chemical Hypoxia mimic cobalt chloride (CoCl₂) and the dose-response effect and the expression of HIF-1α and its targets Glu1 and Vegfa were evaluated, evaluation of the effect of Hypoxia on the components and targets of the BMP signaling pathway and the effects of the secretome, contained in the conditioned medium of MSCs^BMP-9+ under Hypoxia (MC Hypoxia) on the viability, cell migration and osteoblastic differentiation of MSCs and osteoblasts. The results demonstrated that concentrations greater than 100 µM of CoCl,₂ reduced viability in all evaluated periods (p<0.001). Hypoxia induced by 40 µM CoCl₂ in the last 3 days did not affect the cell viability of MSCs^BMP-9+, resulted in higher protein expression of HIF-1α and 4 h after removal of Hypoxia an increase in gene expression of Glu1 and Vegfa when compared to Control. Hypoxia did not affect BMP-9 protein expression and Bmp-4, Smad5 and Runx2 gene expression, but upregulated Bmp-2, Bmpr1a, Smad1 and Hey1 gene expression. MC Hypoxia did not affect the cell viability of MSCs and osteoblasts in all periods evaluated, but it increased the migration of MSCs and osteoblasts, as well as increased osteoblastic differentiation as revealed by the expression of RUNX2 and ALP proteins, without affecting the ALP activity in MSCs and osteoblasts. Our data indicate that Hypoxia regulates the BMP signaling pathway in MSCs^BMP-9+ and that MC derived from these cells cultured under Hypoxic conditions enhances cell migration and osteoblastic differentiation of MSCs and osteoblasts. The use of MC or molecules secreted by MSCs overexpressing BMP9 cultured under Hypoxia have the potential to increase bone formation.