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Tese de Doutorado
DOI
Documento
Autor
Nome completo
Helena Bacha Lopes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Beloti, Márcio Mateus (Presidente)
Rosa, Adalberto Luiz
Silva, Cristina Antoniali
Silva, Tarcilia Aparecida da
Título em português
Participação de integrinas na diferenciação osteoblástica induzida por superfícies de titânio com nano e microtopografia
Palavras-chave em português
CRISPR/Cas9
Integrina
Nanotopografia
Osteoblasto
ShRNA
Titânio
Resumo em português
As integrinas constituem uma família de receptores de membrana que tem como função primária a adesão de células a proteínas da matriz extracelular e alguns de seus membros estão envolvidos nos processos de diferenciação osteoblástica e formação óssea, eventos diretamente relacionados à osseointegração de implantes de titânio (Ti). Sabe-se que superfícies de Ti com nano e microtopografia podem favorecer a diferenciação osteoblástica e a mineralização da matriz extracelular. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses processos não são completamente entendidos. Neste contexto, os objetivos deste estudo foram: (1) caracterizar as superfícies de Ti com nano (Ti-Nano) e microtopografia (Ti-Micro), (2) investigar a participação da integrina V na diferenciação osteoblástica induzida pelo Ti-Nano e (3) investigar a participação da integrina β3 na diferenciação osteoblástica induzida por Ti-Nano e Ti-Micro. Para isso, discos de Ti-Nano e Ti-Micro foram preparados por ataque ácido com H2SO4/H2O2 ou com HNO3/H2SO4 / HCl, respectivamente, e caracterizados quanto à topografia, rugosidade e composição química de superfície. Discos de Ti usinados foram usados com controle (Ti-Controle) em alguns experimentos. Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea de ratos foram cultivadas sobre as três superfícies de Ti e foi avaliada a expressão gênica de componentes envolvidos na via de sinalização das integrinas por PCR array. Com base nos resultados do PCR array, as integrinas αV e β3 foram selecionadas e silenciadas por RNA de interferência (shRNA) ou CRISPR/Cas9, respectivamente, em células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 para investigarmos a participação dessas integrinas na diferenciação osteoblástica induzida por superfícies de Ti com diferentes topografias. Os resultados deste estudo mostraram que os tratamentos empregados foram eficientes para a produção de superfícies de Ti com topografias nas escalas nano e micrométrica. Além disso, foi demonstrado que o maior potencial osteogênico do Ti-Nano se deve, ao menos em parte, à integrina αV, uma vez que seu silenciamento reduziu a diferenciação osteoblástica induzida pela nanotopografia. Por fim, também demonstramos que a via de sinalização ativada pela integrina β3 exerce um papel fundamental no potencial osteogênico do Ti-Nano, mas não do Ti-Micro. O silenciamento da integrina β3 reduziu a diferenciação osteoblástica, concomitantemente com a regulação negativa da expressão de vários componentes das vias de sinalização de Wnt e de BMP, apenas nas células crescidas sobre a nanotopografia. Em conjunto, nossos resultados revelam um novo mecanismo para explicar a maior diferenciação osteoblástica induzida pelo Ti-Nano, que envolve uma complexa rede regulatória ativada pela maior expressão das integrinas αV e β3, esta última gerando ativação da transdução de sinal das vias de Wnt e de BMP
Título em inglês
Role of integrins on the osteoblast differentiation induced by titanium surfaces with nano and microtopography
Palavras-chave em inglês
CRISPR/Cas9
Integrin
Nanotopography
Osteoblast
ShRNA
Titanium
Resumo em inglês
Integrins are a family of membrane receptors that primarily mediate cell adhesion to extracellular matrix proteins and some members are involved in the process of osteoblast differentiation and bone formation, key events of titanium (Ti) implant osseointegration. It is well known that Ti surfaces with nano and microtopography may favor osteoblast differentiation and matrix mineralization. However, the cellular mechanisms involved in this process are not entirely understood. In this context, the aims of this study were: (1) to characterize the Ti surfaces with nano (Ti-Nano) and microtopography (Ti-Micro), (2) to investigate the participation of integrin V on osteoblast differentiation induced by Ti-Nano and (3) to investigate the participation of integrin β3 on osteoblast differentiation induced by Ti-Nano and Ti-Micro. Discs of Ti-Nano and Ti-Micro were prepared with acid etching with H2SO4/H2O2 or with HNO3/H2SO4 / HCl, respectively, and characterized in terms of surface topography, roughness and chemical composition. Machined Ti discs (untreated) were used as control (Ti-Control) in some experiments. Mesenchymal stem cells from rat bone marrow were cultured on Ti discs with the three different surfaces and the gene expression of members of the integrin signaling pathway was evaluated by PCR array. Based on PCR array results, the integrins αV and β3 were selected and silenced using RNA interference (shRNA) or CRISPR-Cas9, respectively, in pre-osteoblastic cell line MC3T3-E1 to investigate the participation of these integrins in osteoblast differentiation induced by Ti with different surface topographies. The results showed that the treatments used were efficient to generate Ti surfaces with topographies at the nano and micrometric scales. We showed that the higher osteogenic potential of Ti-Nano may be, at least in part, due to the integrin &alphaV, since its silencing reduced the osteoblast differentiation induced by nanotopography. We also demonstrated that the signaling pathway triggered by integrin β3 plays a key role in the osteogenic potential of Ti-Nano, but not of Ti-Micro. The silencing of integrin β3 reduced the osteoblast differentiation concomitantly with the negative regulation of the gene expression of several Wnt and BMP signaling components only in cells grown on Ti-Nano. Taken together, our results uncover a novel mechanism to explain the higher osteoblast differentiation induced by Ti-Nano that involves a complex regulatory network triggered by integrins αV and β3 upregulation, with the integrin β3 activating the Wnt and BMP signal transductions
 
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Data de Publicação
2019-07-18
 
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