• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.58.2019.tde-30092022-102310
Documento
Autor
Nome completo
Carolina Maschietto Pucinelli
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2019
Orientador
Banca examinadora
Segato, Raquel Assed Bezerra (Presidente)
Cerri, Paulo Sérgio
Queiroz, Alexandra Mussolino de
Sousa, Yara Teresinha Corrêa Silva
Título em português
Caracterização de células e moléculas do sistema imune inato envolvidas na progressão e tratamento de lesão periapical e no desenvolvimento da doença periodontal
Palavras-chave em português
Cultura de células
IFI16
Imunohistoquímica
Lesão periapical
Luminex®
Macrófagos M1
Macrófagos M2
Periodontite
qRT-PCR
Resumo em português
O sistema imune inato representa a primeira de linha de defesa do nosso organismo. Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRRs) são expressos pelas células desse sistema, como os macrófagos, reconhecendo os micro-organismos e apresentando os antígenos ao sistema imune adaptativo. Dentre os PRRs destaca-se o IFI16 (Proteína induzível por interferon gama 16), uma proteína multifuncional com ação anti-inflamatória. No entanto, o papel da IFI16 na Odontologia ainda é pouco conhecido. Assim, o primeiro o objetivo desse trabalho foi caracterizar a fonte celular da IFI16 na progressão da periodontite induzida experimentalmente em camundongos, a fim de verificar se as células derivadas da medula óssea poderiam ser a fonte da expressão da IFI16 na periodontitite. Inicialmente foi realizada a depleção da medula óssea de animais wild-type (WT) e de animais Ifi204-/- (ortólogo para IFI16). Em seguida, foi realizado o transplante de medula óssea entre animais Ifi204-/- e WT. Após 21 dias do transplante, a periodontite foi induzida em ambos os grupos experimentais pelo modelo de ligadura. Decorridos 9 dias, foi realizada citometria de fluxo da medula óssea utilizando o CD45 como um marcador hematopoiético para determinar o sucesso do transplante. A perda óssea alveolar foi medida pela análise de µCT. Os dados foram analisados pelo teste "t" usando o software GraphPad Prism 7.0a (a=5%). Trinta dias após o transplante, a eficiência de reconstituição encontrada foi de cerca de 80% com base no CD45.1/2. Camundongos com as células transplantadas do animal Ifi204-/-, não mostraram diferença significativa de perda óssea média em comparação com camundongos com as células transferidas de animal WT [0,35mm (DP=0,058mm) vs. 0,43mm (DP=0,104mm) respectivamente, p>0,05]. Assim, o transplante de medula óssea demonstrou que a origem das células que expressam IFI16 durante a progressão da periodontite não são de origem hematopoiética. O segundo objetivo desse estudo foi avaliar, por meio de imunohistoquímica, a participação da IFI16 e IFN-α/β na gênese e no desenvolvimento da lesão periapical induzida em dentes de camundongos. De um total de 45 camundongos C57BL/6, foi realizada a indução da lesão periapical nos primeiros molares inferiores em 40 animais divididos nos períodos experimentais de 2, 7, 14, 21 e 42 dias. Oito animais de cada período experimental e 5 animais do grupo controle foram eutanasiados e os espécimes submetidos ao processamento histotécnico para imunomarcação para a descrição da presença/ausência e localização da IFI16 e IFN-α/β (análise qualitativa). Após análise dos resultados, concluiu-se que a IFI16 e os IFN-α/β participaram da progressão da lesão periapical induzida experimentalmente em dentes de camundongos. Paralelamente, os macrófagos são células fagocíticas, conhecidas por apresentarem uma considerável heterogeneidade em termos morfológicos, funcionais e expressão de marcadores. Dependendo do microambiente ao qual os monócitos, suas células progenitoras, estão expostos, há a definição do seu fenótipo em "classicamente ativado" (M1) ou "alternativamente ativado" (M2). Os macrófagos M1 promovem um ambiente altamente microbicida e têm papel na mediação da destruição de patógenos e células tumorais. Já os macrófagos M2 desempenham um papel central nas respostas frente às infestações parasitárias, remodelação tecidual, angiogênese e doenças alérgicas. Assim, o terceiro objetivo desse trabalho foi a caracterização fenotípica de macrófagos M1 e M2 no desenvolvimento da lesão periapical induzida em dentes de camundongos. Um total de 130 camundongos C57BL/6 foram divididos em grupos controle (dentes hígidos; n=50 animais) e experimental (dentes com lesão periapical experimentalmente induzida; n=80 animais). Decorridos os períodos de 2, 7, 14, 21 e 42 dias, animais controles e experimentais foram eutanasiados e os espécimes submetidos ao processamento histotécnico, para a descrição das características dos tecidos apicais e periapicais em cortes corados com HE, sob microscopia convencional. Além dissa, sob microscopia de fluorescência foi realizada a morfometria para medir a área das lesões periapicais. Foi realizado, também, o qRT-PCR para análise de expressão gênica de Cxcl10, CxCL9, iNos2, Arg1, Ym1, Fizz1 e MRC1 e ensaio Luminex®, para a marcadores de macrófagos M1 e M2 (GM-CSF, IFN-g, IL-4, IL-13, IL- 10, IL-6, IL-1β e TNF-α). Para os dados da morfometria realizou-se o teste ANOVA, seguido pelo pósteste de Tukey. Para os valores obtidos de qRT-PCR e Luminex®, realizou-se o teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn. Todos os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism 7.0a (a=5%). Os resultados permitiram concluir que no decorrer dos períodos, a lesão periapical progrediu. Além disso, com base nos resultados de expressão gênica e quantificação das citocinas, observou-se que a progressão da lesão periapical ocorreu de maneira dinâmica. Além disso, houve predomínio do fenótipo M1 nos períodos iniciais da lesão periapical, passando pela tentativa de reparo com o fenótipo M2 aos 14 e 21 dias e voltando ao fenótipo M1 quando a lesão está estabelecida e é caracterizada como crônica. Por fim, o quarto objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de diferentes materiais utilizados no tratamento endodôntico de dentes portadores de necrose pulpar e lesão periapical em modular o fenótipo de macrófagos M1 e M2. Em cultura de células de macrófagos derivados da medula óssea de animais, foi realizada a análise da expressão gênica de marcadores de macrófagos M1 e M2 por meio do qRT-PCR (Cxcl10, CxCL9, iNos2, Arg1 , Ym1, Fizz1 e MRC1) e quantificação de citocinas pelo Luminex® (GM-CSF, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL- 10, IL-6, IL-1β e TNF-α), após exposição aos cinco cimentos endodônticos AH PlusTM, Sealapex XpressTM, EndosequenceTM, BioRootTM, EndomethasoneTM e a pasta Calen®. Para os valores normais utilizou-se ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey. Para os valores não normais, utilizou-se o teste de Kruskall-Wallis. Todos os dados foram analisados usando o software GraphPad Prism 7.0a (α=5%). Conclui-se que os materiais avaliados foram capazes de induzir a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias, além de estimularem um padrão misto de macrófagos (M1/M2).
Título em inglês
Cells and molecules characterization of the innate immune system involved in the progression and treatment of apical periodontitis and the development of periodontal disease
Palavras-chave em inglês
Apical periodontitis
Cell culture
IFI16
Immunohistochemistry
Luminex®
M1 macrophages
M2 macrophages
Periodontitis
qRT-PCR
Resumo em inglês
The innate immune system represents the first defense line of our body. Pattern Recognition Receptors (PRR) are expressed by cells in this system, such as macrophages. They recognize microorganisms and present the antigens to the adaptive immune system. Among the PRRs, IFI16 (interferon gamma inducible protein 16) stands out. It is a multifunctional protein with anti-inflammatory function. However, the role of IFI16 in dentistry is still poorly understood. Thus, the first aim of this study was to characterize the cellular source of IFI16 in the progression of periodontitis experimentally induced in mice. In order to verify if bone marrow-derived cells were the source of IFI16 expression in the periodontitis, was initially performed the bone marrow depletion of animals wild-type (WT) and Ifi204-/- (ortolog to IFI16). Then, bone marrow transplant (BMT) was performed between Ifi204-/- and WT animals. After 21 days of BMT, periodontitis was induced in both groups using the ligature model. In order to determine BMT success, after 9 days was performed flow cytometry using cells from bone marrow. CD45 was used as a hematopoietic marker. Alveolar bone loss was measured by µCT analysis. Data were analyzed using t-test with GraphPad Prism 7.0a software (α=5%). Thirty days after BMT, based on CD45.1/2, the reconstitution efficiency was about 80%. Mice with transplanted cells from animal Ifi204-/- showed no significant difference in mean bone loss compared to mice with animal transferred cells from WT [0.35mm (SD=0.058mm) vs. 0.43mm (SD=0.104mm), respectively p>0.05]. Thus, BMT experiment demonstrated that the source of the cells expressing IFI16 during the progression of periodontitis are not from hematopoietic origin. The second aim of this study was to evaluate, by immunohistochemistry, the participation of IFI16 and IFN-α/β in the genesis and development of apical periodontitis induced in mice teeth. From a total of 45 mice C57BL/6, in 40 animals the apical periodontitis was induced in the lower first molars. They were divided in experimental periods of 2, 7, 14, 21 and 42 days. Eight animals from each experimental period and 5 animals from the control group were euthanized and the specimens submitted to histological process and submitted to immunostaining. After was performed the description of the presence/absence and localization of IFI16 and IFN-α/β (qualitative analysis). After the results analysis, it was concluded that IFI16 and IFN-α/β participated in the progression of apical periodontitis experimentally induced mice teeth. At the same time, macrophages are phagocytic cells, known to have considerable morphological, functional and marker expression heterogeneity. Depending on the microenvironment to which the monocytes, their progenitor cells, are exposed, their phenotype is defined as "classically activated" (M1) or "alternatively activated" (M2). M1 macrophages promote a highly microbicidal environment and play a role in mediating the destruction of pathogens and tumor cells. M2 macrophages play a central role in responses to parasitic infestations, tissue remodeling, angiogenesis and allergic diseases.Thus, the third aim of this work was the phenotypic characterization of M1 and M2 macrophages in the development of apical periodontitis induced in mice teeth. A total of 130 mice C57BL/6 were separated into control (healthy teeth; n=50 animals) and experimental (teeth with experimentally induced apical periodontitis; n=80 animals) groups. After the periods of 2, 7, 14, 21 and 42 days, control and experimental animals were euthanized and the specimens submitted to histotechnical process in order to describe the apical and periapical tissue characteristics in HE stained sections under conventional microscopy. Besides that, under fluorescence microscopy, morphometry was performed to measure the area of the apical periodontitis. Also, were performed qRT-PCR for Cxcl10, CxCL9, iNos2, Arg1, Ym1, Fizz1 and MRC1 gene expression analysis and Luminex® assay for M1 and M2 macrophage markers (GM-CSF, IFN-g, IL-4, IL-13, IL-10, IL-6, IL-1β and TNF-α). For morphometry data, the ANOVA test was performed, followed by Tukey post-test. For the values obtained for qRT-PCR and Luminex®, the Kruskal-Wallis test was performed followed by the Dunn post-test. All data were analyzed using GraphPad Prism 7.0a software (a=5%). The results allowed to conclude that during the experimental periods, the apical periodontitis progressed. In addition, based on the results of gene expression and cytokine quantification, it was observed that the progression of the apical periodontitis occurred dynamically. Besides that, there was a predominance of the M1 phenotype in the early periods of the apical periodontitis, attempting to repair the M2 phenotype at 14 and 21 days and returning to the M1 phenotype when the lesion is established and characterized as chronic process. Finally, the fourth aim of this study was to evaluate the ability of different materials used during endodontic treatment of teeth with pulp necrosis and apical periodontitis in modulate the M1 and M2 macrophage phenotype. In bone marrow-derived macrophage cell culture, gene expression analysis of markers to M1 and M2 macrophages was performed by qRT-PCR (Cxcl10, CxCL9, iNos2, Arg1, Ym1, Fizz1 and MRC1) and cytokine quantification by Luminex® (GM-CSF, IFN-g, IL-4, IL-13, IL-10, IL-6, IL-1β and TNF-α) after exposure to the five endodontic sealers AH PlusTM Sealapex XpressTM, EndosequenceTM, BioRootTM, EndomethasoneTM; and the Calen® paste. For normal values, ANOVA test was used, followed by Tukey post-test. For non-normal values, the Kruskall-Wallis test was used. All data were analyzed using GraphPad Prism 7.0a software (a=5%). It was concluded that the evaluated materials were able to induce the expression of pro and anti-inflammatory cytokines, besides stimulating a mixed macrophage pattern (M1/M2).
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2022-10-03
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
CeTI-SC/STI
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2022. Todos os direitos reservados.