O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação das armadilhas extracelulares de neutrófilos em lesões periapicais induzidas experimentalmente em camundongos wild-type (WT). Para o estudo, foram utilizados 55 animais com 6 a 8 semanas de idade, pesando em média 20 gramas. Com exceção dos animais do período controle (dia 0), todos os demais do grupo experimental apresentaram lesões periapicais induzidas nos primeiros molares mandibulares e foram avaliados após 2, 5, 7, 21 e 42 dias. Após os períodos experimentais, os animais foram eutanasiados, sendo as hemi-mandíbulas direitas dissecadas para posterior análise microscópica por meio de coloração hematoxilina e eosina (HE) (descrição do tecido pulpar e das regiões apical e periapical), histomorfometria em microscopia de fluorescência (mensuração das lesões periapicais), recrutamento de neutrófilos polimorfonucleares na região periapical e imuno-histoquímica (expressão de mieloperoxidase, elastase, PAD4, catepsina G e histona H3 citrulinada). Além disso, as hemi-mandíbulas esquerdas foram submetidas a técnica de biologia molecular RT-PCR para avaliar a expressão gênica de PADI4, MPO, ELANE, H3C1 e CTSG. Os dados numéricos foram analisados por meio dos programa computacional GraphPad 7, sendo empregados os testes: Kruskal-Wallis, ANOVA , Dunn e Mann-Whitney. Todas as conclusões relativas à parte inferencial foram realizadas no nível de 5% de significância. A área da lesão aumentou progressivamente com o tempo, com diferença estatisticamente significativa entre o grupo controle (0 dias) e entre os períodos experimentais de 7, 21 e 42 dias (p<0,05), e também entre 21 e 42 dias. Já para a contagem de neutrófilos, observou-se aumento progressivo com o decorrer do tempo, com maior número nos períodos de 21 e 42 dias, com diferença estatisticamente significativa quando comparados com o grupo controle (p<0,05). Houve, também, diferença estatística ao comparar os dias 2, 5 e 7 com os períodos finais de 21 e 42 dias (p<0,05). Concordantemente, aos 21 e 42 dias houve maior co-localização de MPO e CitH3, sugerindo a participação das Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos (NETs) na lesão periapical, com diferença estatística (p<0,05) entre 21 e 42 dias em relação ao grupo controle. Em geral, houve maior expressão gênica de PADI4 aos 7 dias, com diferença estatística (p<0,05) entre 0 dias em relação a 5 e 21 dias, 2 dias e 5 e 21 dias e entre 21 e 42 dias. Para o gene MPO, observou-se maior expressão em 21 dias, com diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre o grupo controle e os períodos de 2, 5, 7 e 21 dias. Adicionalmente, os períodos de 2, 5 e 7 dias apresentaram diferença estatística em relação a 42 dias. Já a expressão de ELANE foi maior em 5 e 21 dias de lesão, com diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre grupo controle em relação a 5 e 7 dias, e 5 e 7 dias em comparação a 42 dias. Houve maior expressão de H3C1 aos 21 e 42 dias de lesão, com diferença estatística (p<0,05) entre o período de 2 dias em relação a 5, 21 e 42 dias. No entanto, não foi possível observar diferença estatisticamente significativa (p>0,05) entre os grupos experimentais em relação ao grupo controle. Por último, a expressão de CTSG foi maior aos 21 dias de lesão, sendo que o grupo controle e o período de 2 dias foram estatisticamente diferentes (p<0,05) dos períodos de 7 e 21 dias. Os resultados permitiram evidenciar a presença das armadilhas extracelulares de neutrófilos em lesões periapicais induzidas experimentalmente em camundongos, especialmente nos períodos tardios de avaliação, concomitantemente com maior número de neutrófilos. Adicionalmente, as proteínas PAD4 e CTSG também estiveram presentes durante a progressão da lesão periapical, sugerindo ação na degradação tecidual, potencializando a resposta inflamatória e a progressão da lesão periapical.

The aim of the present study was to evaluate the participation of neutrophil extracellular traps in experimentally induced periapical lesions in wild-type (WT) mice. For the study, 55 animals aged 6 to 8 weeks, weighing an average of 20 grams, were used. Except for the animals in the control period (day 0), all animals in the experimental group had periapical lesions induced in the mandibular first molars and were evaluated after 2, 5, 7, 21 and 42 days. After the experimental periods, the animals were euthanized and the right hemimandibles were dissected for subsequent microscopic analysis using hematoxylin and eosin (HE) staining (description of the pulp tissue and the apical and periapical regions), histomorphometry in fluorescence microscopy (measurement of periapical lesions), recruitment of polymorphonuclear neutrofiles in the periapical region and immunohistochemistry (expression of myeloperoxidase, elastase, PAD4, cathepsin G and histone H3 citrullinated). In addition, left hemi-mandibles were subjected to RT-PCR molecular biology technique to evaluate the gene expression of PADI4, MPO, ELANE, H3C1 and CTSG. The numerical data were analyzed using the GraphPad 7 computer program, using the following tests: Kruskal-Wallis, ANOVA, Dunn and Mann-Whitney. All conclusions regarding the inferential part were made at the 5% significance level. The lesion area increased progressively over time, with a statistically significant difference between the control group (0 days) and between the experimental periods of 7, 21 and 42 days (p<0.05), and also between 21 and 42 days. As for the neutrophil count, there was a progressive increase over time, with higher numbers in the periods of 21 and 42 days, with a statistically significant difference when compared to the control group (p<0.05). There was also a statistical difference when comparing days 2, 5 and 7 with the final periods of 21 and 42 days (p<0.05). Concordantly, at 21 and 42 days there was greater co-localization of MPO and CitH3, suggesting the participation of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) in the periapical lesion, with a statistical difference (p<0.05) between 21 and 42 days compared to the control group. In general, there was higher gene expression of PADI4 at 7 days, with statistical difference (p<0.05) between 0 days compared to 5 and 21 days, 2 days and 5 and 21 days, and between 21 and 42 days. For the MPO gene, we observed higher expression at 21 days, with a statistically significant difference (p<0.05) between the control group and the periods of 2, 5, 7 and 21 days. Additionally, the periods of 2, 5 and 7 days showed a statistical difference compared to 42 days. The expression of ELANE was higher at 5 and 21 days of injury, with a statistically significant difference (p<0.05) between the control group compared to 5 and 7 days, and 5 and 7 days compared to 42 days. There was higher expression of H3C1 at 21 and 42 days of injury, with a statistically significant difference (p<0.05) between the 2 day period compared to 5, 21 and 42 days. However, no statistically significant difference (p>0.05) could be observed between the experimental groups compared to the control group. Finally, the expression of CTSG was higher at 21 days of injury, and the control group and the 2-day period were statistically different (p<0.05) from the 7 and 21-day periods. The results showed the presence of extracellular neutrophil traps in experimentally induced periapical lesions in mice, especially in the late periods of evaluation, concomitantly with higher numbers of neutrophils. Additionally, PAD4 and CTSG proteins were also present during periapical lesion progression, suggesting an action on tissue degradation, potentiating the inflammatory response and periapical lesion progression.