Diante do importante papel das espécies reativas de oxigênio (ROS) e das armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) em diferentes patologias sistêmicas e seu potencial na modulação da resposta imunológica, faz-se necessária melhor compreensão dos seus efeitos nos tecidos assim como sua utilização como alvos para futuras estratégias terapêuticas. Assim, para abordar o tema proposto, foram desenvolvidos estudos divididos em 2 objetivos gerais: avaliar a participação da atividade redox durante o desenvolvimento da lesão periapical; e a relação entre espécies reativas de oxigênio e armadilhas extracelulares de neutrófilos na gênese e desenvolvimento da lesão periapical. Para o primeiro estudo, foram utilizados 42 camundongos wild-type (7 animais/por grupo). No grupo controle, os animais estavam com dentes hígidos e nos demais grupos tiveram lesões periapicais induzidas nos primeiros molares inferiores. Após os períodos de 2, 5, 7, 21 e 42 dias, os animais foram eutanasiados e as hemi-mandíbulas direitas foram submetidas ao processamento histotécnico de rotina e as lâminas obtidas foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) para descrição das características do conteúdo do canal radicular e das regiões apical e periapical (microscopia convencional) e histomorfometria da área das lesões periapicais (microscopia modo fluorescente). Além disso, foram realizadas reações de imuno-histoquímica para avaliação da presença/ausência e localização das enzimas oxidantes mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), glutationa redutase (GR) e catalase (CAT). Já as hemi-mandíbulas esquerdas foram submetidas ao processamento para a técnica de qRT-PCR e avaliação da expressão de RNAm das mesmas enzimas citadas anteriormente. Para os dados da morfometria realizou-se o teste Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn. Para os dados da imuno-histoquímica, realizou-se o teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn e de Mann- Whitney. Ambas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do software GraphPad Prism 9. Já para os dados de expressão gênica, realizou-se o teste ANOVA com pós-teste com contraste ortogonal por meio do software SAS/STAT®. Ainda, foi realizado o teste de correlação de Spearman para avaliar o grau de correlação entre a expressão de genes e o tamanho da lesão periapical. O nível de significância adotado para todas as análises foi de 5%. Os resultados permitiram concluir que no decorrer dos períodos, a lesão periapical progrediu. Houve aumento da expressão gênica das enzimas MPO, CAT, SOD e GR no dia 5, em comparação com o grupo controle (p<0,05). A expressão gênica da iNOS aumentou nos dias 21 e 42 dias em relação ao controle (p<0,05). Também foi possível observar correlação moderada entre MPO e CAT (0,7), entre iNOS e a lesão periapical (0,6) e correlação forte entre MPO e GR (0,8). Além disso, a imunomarcação de todas as enzimas se apresentou mais intensa nos períodos crônicos, porém apenas a MPO teve diferença entre esses grupos e o controle (p<0,05) e a iNOS, maior aos 5 dias, em comparação ao de 2 e 7 dias (p<0,05) e aos 42 dias, em relação ao de 7 dias (p=0,03). Assim, observou-se nos períodos iniciais do desenvolvimento da lesão periapical o aumento da atividade redox. Nas lesões crônicas, teve exposição prolongada de ROS, observadas pela imunomarcação. O aumento da expressão de iNOS teve correlação com o tamanho das lesões periapicais e sua marcação aos 42 dias, parece estar associada à destruição óssea e cementária, sugerindo o importante papel da atividade redox como mecanismo de defesa e na patogênese das lesões periapicais. Para o segundo objetivo proposto, de avaliação da relação das NETs e ROS no desenvolvimento de lesões periapicais, foram utilizados 42 camundongos wild-type (7 animais/grupo), sendo o controle o grupo de animais com entes hígidos e os demais grupos com lesões periapicais induzidas nos primeiros molares inferiores. Após os períodos de 2, 5, 7, 21 e 42 dias, as amostras foram avaliadas para descrição do canal radicular e das regiões apical e periapical, histomorfometria da área das lesões periapicais e contagem do número de neutrófilos. Além disso, foram realizadas reações de imunohistoquímica para avaliação da co-localização dos marcadores de NETs, elastase de neutrófilo (NE) e histona 3 citrulinada (H3Cit) e MPO e H3Cit. Adicionalmente, também foi avaliada a expressão gênica de NE e H3Cit por qRT-PCR. Foi observado maior número de neutrófilos nos períodos de 21 e 42 dias, com diferença com os demais grupos (p<0,05). A formação de NETs também foi maior nesses períodos (21 e 42 dias), evidenciada pela co-localização tanto de NE e H3Cit como de MPO e H3Cit. Após a obtenção dos resultados de ambos os estudos pode-se concluir que, durante o desenvolvimento da lesão periapical, pode-se evidenciar o stress oxidativo, maior atividade de neutrófilos e formação de NETs, especialmente nos períodos mais tardios de avaliação que correspondem à cronificação, o que pode indicar a relação entre a formação de ROS e a liberação de NETs com a destruição tecidual periapical.

Given the vital role of reactive oxygen species (ROS) and neutrophil extracellular traps (NETs) in different systemic pathologies and their potential to modulate the immune response, it is necessary to understand their effects on tissues better, as well as their use as targets for future therapeutic strategies. Thus, to address the proposed theme, it was developed studies divided into 2 general objectives were developed: to evaluate the participation of redox activity during the formation and development of the periapical lesion; and the relationship between reactive oxygen species and neutrophil extracellular traps in the genesis and development of the periapical lesion. For the first study, 42 wild-type mice (7 animals/group) were used, the control group had sound teeth and the others had periapical lesions induced in the mandibular first molars. After periods of 0, 2, 5, 7, 21, and 42 days, the animals were euthanized. The right hemi-mandibles were submitted to routine histotechnical processing, and the obtained slides were stained with hematoxylin and eosin (HE) for the description of the root canal contents description and apical and periapical regions (conventional microscopy) and histomorphometry of the area of periapical lesions (fluorescent mode microscopy). In addition, immunohistochemical reactions were performed to assess the presence/absence and location of the oxidizing enzymes myeloperoxidase (MPO) and inducible nitric oxide synthase (iNOS), and the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GR) and catalase (CAT). The left hemi-mandibles were submitted to processing for the qRTPCR technique and evaluation of mRNA expression of the same enzymes mentioned above. The Kruskal-Wallis test was performed for the morphometry data, followed by the Dunn post-test. The Kruskal-Wallis test and the Dunn and Mann-Whitney post-test were performed for immunohistochemical data. Both statistical analyses were performed using the GraphPad Prism 9 software. The ANOVA test was performed with a post-test with orthogonal contrast using the SAS/STAT® software for the gene expression data. Furthermore, Spearman's correlation test was performed to assess the degree of correlation between gene expression and the size of the periapical lesion. The significance level adopted for all analyzes was 5%. The results allowed us to conclude that, over time, the periapical lesion progressed. There was an increase in the gene expression of MPO, CAT, SOD, and GR enzymes on day 5 compared to the control group (p<0.05). iNOS gene expression increased on days 21 and 42 compared to the control (p<0.05). It was also possible to observe a moderate correlation between MPO and CAT (0.7), between iNOS and the periapical lesion (0.6), and a strong correlation between MPO and GR (0.8). In addition, the immunostaining of all enzymes was more intense in the chronic periods. However, only MPO had a difference between these groups and the control (p<0.05), and iNOS was higher at 5 days compared to 2 and 7 days (p<0.05) and at 42 days, compared to 7 days (p=0.03). Thus, redox activity was increased in the initial periods of development of the periapical lesion. In chronic lesions, there was prolonged exposure of ROS, observed by immunostaining. The increase in iNOS expression correlated with the size of the periapical lesions, and its marking at 42 days seems to be associated with bone and cemental destruction, suggesting the important role of redox activity as a defense mechanism and in the pathogenesis of periapical lesions. For the second proposed objective, evaluating the relationship between NETs and ROS in the development of periapical lesions, 42 wild-type mice (7 animals/experimental period) were used, with periapical lesions induced in the lower first molars. After 0, 2, 5, 7, 21, and 42 days, the samples were evaluated for the description of the root canal and the apical and periapical regions, histomorphometry of the area of periapical lesions, and count of the number of neutrophils. In addition, immunohistochemical reactions were performed to assess the colocalization of NET markers, neutrophil elastase (NE), and citrullinated histone 3 (H3Cit) and MPO and H3Cit. Additionally, NE and H3Cit gene expression was also evaluated by qRT-PCR. More neutrophils were observed in the 21 and 42 days, with a difference with the other groups (p<0.05). The formation of NETs was also increased in these periods (21 and 42 days), evidenced by the colocalization of both NE and H3Cit and MPO and H3Cit. After obtaining the results of both studies, it can be concluded that, during the development of the periapical lesion, oxidative stress, more significant activity of neutrophils, and formation of NETs can be evidenced, especially in the later periods of evaluation that correspond to chronic period, which may indicate the relationship between the formation of ROS and the release of NETs and its role in periapical tissue destruction.