O processo infeccioso e inflamatório que ocorre durante a progressão da lesão periapical estimula a ativação de diferentes células, mediadores e receptores do sistema imune do hospedeiro. No contexto de doenças sistêmicas, é reconhecido que o lipopeptídeo sintético denominado Pam3cys atua como ligante de TLR2/TLR1 e, além de estimular a expressão de diferentes citocinas inflamatórias, pode modificar o papel dos linfócitos T regulatórios (Tregs). Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a participação dos Tregs na presença ou não do ligante Pam3Cys durante a progressão da lesão periapical induzida em camundongos. Foram utilizados 130 camundongos machos C57BL/6 wild type (WT) e knockout para TLR2 (TLR2KO), alocados em grupos controle (n=5) e experimental (indução da lesão periapical) (n=10/período experimental). Em grupos específicos (WT+Pam3cys e TLR2KO+Pam3cys), o ligante sintético Pam3cys foi administrado intraperitonealmente, a cada 7 dias, de acordo com o período experimental (14, 21 e 42 dias). Para os demais grupos, foi administrada água livre de endotoxina. Ao final dos períodos experimentais, os animais foram eutanasiados sendo a mandíbula e o baço submetidos ao processamento histotécnico. Os cortes histológicos foram analisados pela coloração com hematoxilina e eosina (análise da reação inflamatória e mensuração da lesão periapical), pela histoenzimologia para atividade da fosfatase ácida resistente ao tartarato - TRAP (avaliação do número de osteoclastos). Além disso, foi realizada a técnica de imunohistoquímica para a identificação da expressão de Tregs (marcador FOXP3 na mandíbula e no baço) e a avaliação da osteoclastogênese, utilizando os marcadores RANK, RANKL e OPG (mandíbula). Os dados foram analisados pelo programa GraphPad Prism 8.0.1, por meio do teste ANOVA seguido pelo pós-teste de Tukey, Teste T e Teste Mann-Whitney (α=5%). Foi observado que o infiltrado inflamatório e a reabsorção óssea foram mais intensos no grupo TLR2KO, em comparação com o WT. Além disso, os animais que receberam o ligante Pam3cys, tanto animais WT quanto TLR2KO, apresentaram um infiltrado inflamatório leve ou moderado e lesões periapicais menores (p<0,05). Os animais TLR2KO apresentaram um aumento significativo no número de osteoclastos quando comparado aos animais TLR2KO+Pam3cys (p<0,05), em todos os períodos de desenvolvimento da lesão periapical. Os animais WT+Pam3cys apresentaram menor número de osteoclastos quando comparados aos animais WT que não receberam o ligante, aos 21 dias (p=0,02). A expressão de Tregs foi mais intensa nos grupos que receberam o ligante Pam3cys, com diferença observada principalmente no grupo WT+Pam3cys (p=0,03) quando comparado ao grupo WT, no período de 42 dias. Já nos animais TLR2KO, a administração do ligante não aumentou a proliferação de Tregs. Na análise do baço, os animais WT que receberam o ligante também tiveram maior expressão de Tregs, no período de 14 e 42 dias (p=0.02). Já nos animais TLR2KO, o aumento da expressão de Tregs só aconteceu aos 21 dias (p=0.02) nos animais que receberam o Pam3cys. Com relação ao RANKL, notou-se uma redução da marcação nos grupos TLR2KO+Pam3cys, aos 21 e 42 dias (p=0.03) e maior razão de ligação entre RANK/RANKL nos animais que não receberam o lipopeptídeo. Com relação ao OPG, os animais que receberam a administração do Pam3cys tiveram maior expressão dessa proteína, com diferença estatística no período de 21 dias (p=0.01) para o grupo WT+Pam3cys e para os animais TLR2KO +Pam3cys, essa diferença ocorreu aos 42 dias (p=0.02). A partir das metodologias realizadas e dos resultados, pode-se concluir que nos animais WT, a administração do ligante Pam3cys aumentou a proliferação dos Tregs e preveniu a progressão da lesão periapical em camundongos. Por outro lado, na ausência do receptor TLR2 nos animais KO, a expressão de Tregs foi menor com maiores áreas de lesões periapicais. Por fim, a administração sistêmica do ligante Pam3cys nos animais KO foi capaz de limitar os efeitos deletérios da ausência do receptor TLR2 com menores áreas de lesão periapical, menor expressão de Tregs e RANKL, menor número de osteoclastos e maior expressão de OPG.

The infectious and inflammatory process that occurs during the progression of the periapical lesion stimulates the activation of different cells, mediators, and receptors of the host's immune system. In the context of systemic diseases, it is recognized that the synthetic lipopeptide Pam3cys acts as a TLR2/TLR1 ligand and, in addition to stimulating the expression of different inflammatory cytokines, it can modify the role of regulatory T lymphocytes (Tregs). Thus, the present study aimed to evaluate the participation of Tregs in the presence or absence of the Pam3Cys ligand during the progression of the periapical lesion induced in mice. The sample consisted of 130 male C57BL/6 wild type (WT) and TLR2 knockout (TLR2KO) mice, allocated in control (n=5) and experimental (periapical lesion induction) (n=10/experimental period) groups. In specific groups (WT+Pam3cys and TLR2KO+Pam3cys), the Pam3cys synthetic ligand was administered intraperitoneally, every 7 days, according to the experimental period (14, 21, and 42 days). For the other groups, endotoxin-free water was administered. At the end of the experimental periods, the animals were euthanized and the mandible and spleen were submitted to histotechnical processing. The histological sections were analyzed by staining with haematoxylin and eosin (analysis of the inflammatory reaction and measurement of the periapical lesion), tartrate-resistant acid phosphatase histoenzymology - TRAP (evaluation of the number of osteoclasts). In addition, the immunohistochemistry technique was performed to identify the expression of Tregs (FOXP3 staining in the mandible and spleen) and the evaluation of osteoclastogenesis, using the RANK, RANKL, and OPG markers (mandible). Data were analyzed using the GraphPad Prism 8.0.1 program, using the ANOVA test followed by the Tukey post-test, T-test, and Mann-Whitney test (α =5%). It was observed that the inflammatory infiltrate and bone resorption was more intense in the TLR2KO group compared to the WT group. In addition, the animals that received the Pam3cys ligand, both WT and TLR2KO animals, showed a mild or moderate inflammatory infiltrate and smaller periapical lesions (p<0.05). TLR2KO animals showed a significant increase in the number of osteoclasts when compared to TLR2KO+Pam3cys animals (p<0.05), in all periods of periapical lesion development. WT+Pam3cys animals had a lower number of osteoclasts when compared to the WT animals that did not receive the ligand, with this difference being statistically significant at 21 days (p=0.02). Tregs expression was more intense in the groups that received the Pam3cys ligand, with a difference observed mainly in the WT+Pam3cys group (p=0.03) when compared to the WT group, in the 42 days. In KO animals, however, administration of the ligand did not increase Tregs proliferation. In the spleen analysis, the WT animals that received the ligand also had a higher expression of Tregs, in the period of 14 and 42 days (p=0.02). In the TLR2KO animals, however, the increase in Tregs expression only ocurred at 21 days (p=0.02) in the animals that received Pam3cys. Concerning RANKL, there was a reduction in staining in the TLR2KO+Pam3cys groups, at 21 and 42 days (p=0.03) and a higher binding ratio between RANK/RANKL in animals that did not receive the ligand. Regarding OPG, the animals that received Pam3cys had a higher expression of this protein, with a statistical difference in the period of 21 days (p=0.01). Also, for the WT+Pam3cys group and the TLR2KO+Pam3cys animals, OPG difference occurred at the 42 days (p=0.02). Based on the methodologies performed and the obtained results, it can be concluded that in WT animals, the administration of the Pam3cys ligand increased the proliferation of Tregs and prevented the progression of the periapical lesion in mice. On the other hand, in the absence of the TLR2 receptor in KO animals, Tregs expression was lower with larger areas of periapical lesions. Finally, systemic administration of the Pam3cys ligand in KO animals was able to limit the deleterious effects of the absence of the TLR2 receptor with smaller areas of periapical lesion, lower expression of Tregs and RANKL, lower number of osteoclasts and higher expression of OPG.