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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.58.2019.tde-09102019-131641
Documento
Autor
Nome completo
Ana Patrícia de Sousa Pereira
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2019
Orientador
Banca examinadora
Segato, Raquel Assed Bezerra (Presidente)
Faria, Gisele
Oliveira, Katharina Morant Holanda de
Politi, Marília Pacifico Lucisano
Título em português
Efeito do alendronato em lesões periapicais e avaliação da composição da microbiota bucal de ratas, em condições de hipoestrogenicidade
Palavras-chave em português
Alendronato
Biologia molecular
Lesão periapical
Microbiota
Osteoporose
Ovariectomia
Resumo em português
Os objetivos desse estudo foram avaliar: o efeito do ALN no desenvolvimento de lesões periapicais (LP) induzidas em ratas ovariectomizadas (Capítulo 1); a influência da redução dos níveis de estrógeno na composição microbiana da cavidade bucal e consequentemente no desenvolvimento da lesão periapical (Capítulo 2). Para a realização do estudo do Capítulo 1, 25 ratas foram divididas em 3 grupos: sham (controle), ovariectomia (OVX), e OVX+ALN. Um dia após a realização da OVX, os animais do grupo OVX+ALN começaram a receber a medicação, via gavagem. Decorridas 9 semanas, os primeiros molares de todos os animais foram submetidos à indução de LP. Após 21 dias, foi realizada a eutanásia dos animais. Fêmures foram analisados para registro da densidade mineral óssea (BMD) e os blocos de tecido ósseo contendo os primeiros molares inferiores foram submetidos ao processamento histotécnico e à coloração com hematoxilina e eosina (HE) para análise da LP em microscopia convencional. Paralelamente, foi realizada a análise morfométrica da área das LP por imunofluorescência, histoenzimologia para a quantificação de osteoclastos e coloração de DAPI para quantificação de osteócitos apoptóticos. Além disso, os primeiros molares superiores foram utilizados para a análise da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e marcadores da osteoclastogênese (RANKL/OPG). Já para a realização do estudo do Capítulo 2, 36 ratas foram divididas em 4 grupos: sham (controle), ovariectomia (OVX), sham + lesão periapical (Sham+LP) e ovariectomia + lesão periapical (OVX+LP). A indução da LP também ocorreu após 9 semanas seguindo o mesmo protocolo descrito acima. Após o período experimental de 21 dias, foi realizada a colheita microbiológica da cavidade bucal dos animais, por meio de esfregaço com microbrush nas regiões de bochechas, assoalho bucal e língua e posteriormente os animais foram submetidos à eutanásia. As amostras foram analisadas pelo método Checkerboard DNA-DNA Hybridization, para verificar a presença de 40 espécies bacterianas as quais foram divididas em complexos microbianos de Socransky. A análise da área das lesões periapicais foi realizada por microscopia de flourescência. Os resultados foram submetidos aos testes ANOVA e Kruskal-Wallis e aos pós-testes de Tukey e Dunn, com nível de significância de 5%. A análise dos resultados do Capítulo 1 permitiu evidenciar que a OVX reduziu a BMD do fêmur e o tratamento com ALN foi capaz de prevenir a perda óssea (p<0,001). Com relação à análise microscópica da região periapical, em HE, os grupos sham e OVX+ALN apresentaram ligamento periodontal e infiltrado inflamatório moderadamente aumentados, enquanto o grupo OVX apresentou esses parâmetros intensamente aumentados. As lesões periapicais do grupo OVX foram significantemente maiores, em comparação aos demais grupos (p<0,001). O grupo OVX apresentou a maior quantidade de osteócitos apoptóticos e o ALN foi capaz de prevenir a apoptose dessas células, além de reduzir significantemente a expressão de IL-6 (p<0,05). A OVX e o ALN não tiveram efeito na expressão de RANKL/OPG e não influenciaram no número de osteoclastos ao redor da LP (p>0,05). Já a análise dos resultados do Capítulo 2 permitiu evidenciar que a microbiota bucal foi alterada em condições de deficiência de estrógeno. Os grupos OVX apresentaram maior quantidade de bactérias, em comparação ao grupo SHAM, na maioria dos complexos microbianos (p<0,001), com exceção dos complexos roxo e amarelo, nos quais esse aumento numérico não foi estatisticamente significante, e do verde, que apresentou uma distribuição mais homogênea entre os grupos (p>0,05). Os animais do grupo controle (com ou sem lesão), sem considerar a influência da deficiência de estrógeno, não apresentaram diferença estatisticamente significante (p>0,001) em nenhum dos complexos microbianos. As lesões periapicais nos animais OVX apresentaram-se significativamente maiores em comparação aos animais SHAM (p<0,001). Pode-se concluir que a condição hipoestrogênica induzida pela OVX agravou a reabsorção óssea, induzindo a morte de osteócitos e estimulando LP maiores. O tratamento com ALN reduziu a apoptose de osteócitos e a inflamação, reduzindo a reabsorção óssea em LP de ratas ovariectomizadas. Com relação à microbiota bucal, a condição de hipoestrogenicidade aumentou a quantidade de bactérias e alterou o perfil microbiano na saliva, influenciando na progressão de lesões periapicais.
Título em inglês
Effect of alendronate on periapical lesions and evaluation of the oral microbiota composition of rats, under conditions of hypoestrogenicity
Palavras-chave em inglês
Alendronate
Microbiota
Molecular biology
Osteoporosis
Ovariectomy
Periapical lesions
Resumo em inglês
The aim of this study was to evaluate the effect of ALN on the development of induced periapical lesions (PL) in ovariectomized rats (Chapter 1); the influence of estrogen levels reduction in the microbial composition of the oral cavity and consequently in the development of the periapical lesion (Chapter 2). For the study of Chapter 1, 25 rats were divided into 3 groups: sham (control), ovariectomy (OVX), and OVX + ALN. One day after OVX, animals from the OVX + ALN group started receiving the medication via gavage. After 9 weeks, the first molars of all animals were submitted to PL induction. After 21 days, the animals were euthanized. Femurs were analyzed for bone mineral density (BMD) and bone tissue blocks containing the first lower molars were submitted to histotechnical processing and staining with hematoxylin and eosin (HE) for PL analysis under conventional microscopy. In parallel, the morphometric analysis of the PL area by immunofluorescence, histoenzimology for the quantification of osteoclasts and DAPI staining for the quantification of apoptotic osteocytes was performed. In addition, the first maxillary molars were used for the analysis of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and TNF-α) gene expression and osteoclastogenesis markers (RANKL / OPG). For the study of Chapter 2, 36 rats were divided into 4 groups: sham (control), ovariectomy (OVX), sham + periapical lesion (Sham + PL) and ovariectomy + periapical lesion (OVX + PL). Induction of PL also occurred after 9 weeks following the same protocol described above. After the 21-day experimental period, the microbiological collection of the oral cavity of the animals was performed by smearing with microbrush in the regions of the cheeks, buccal floor and tongue and later the animals were submitted to euthanasia. The samples were analyzed by the Checkerboard DNA-DNA Hybridization method, to verify the presence of 40 bacterial species which were divided into Socransky microbial complexes. The analysis of the periapical lesion area was performed by fluorescence microscopy. The results were submitted to ANOVA and Kruskal-Wallis tests and Tukey and Dunn post-tests, with a significance level of 5%. Analysis of the results from Chapter 1 showed that OVX reduced femoral BMD and ALN treatment was able to prevent bone loss (p<0,001). Regarding the microscopic analysis of the periapical region, in the HE, the sham and OVX + ALN groups presented moderately increased periodontal ligament and inflammatory infiltrate, while the OVX group presented these parameters intensely increased. The periapical lesions of the OVX group were significantly higher in comparison to the other groups (p <0.001). The OVX group had the highest amount of apoptotic osteocytes and the ALN was able to prevent apoptosis of these cells, in addition to significantly reducing the expression of IL-6 (p<0,05). OVX and ALN had no effect on RANKL / OPG expression and did not influence the number of osteoclasts around PL (p> 0.05). The analysis of the results of Chapter 2 showed that the oral microbiota was altered under conditions of estrogen deficiency. The OVX groups had a higher amount of bacteria compared to the SHAM group in most of the microbial complexes (p <0.001), except for the purple and yellow complexes, in which this numerical increase was not statistically significant, and the green one, which presented a more homogeneous distribution between groups (p>0,05). The animals in the control group (with or without lesion), disregarding the influence of estrogen deficiency, did not present a statistically significant difference (p> 0.001) in any of the microbial complexes. The periapical lesions in OVX animals were significantly higher compared to SHAM animals (p<0,001). It can be concluded that the hypoestrogenic condition induced by OVX aggravated bone resorption, inducing the death of osteocytes and stimulating larger PL. Treatment with ALN reduced osteocyte apoptosis and inflammation, reducing bone resorption in PL of ovariectomized rats. Regarding the oral microbiota, the condition of hypoestrogenicity increased the amount of bacteria and altered the microbial profile, influencing the progression of periapical lesions.
 
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Data de Publicação
2022-10-05
 
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