Os osteoclastos são células reguladoras do volume ósseo que demandam um alto gasto energético para se diferenciarem e exercerem a sua função de reabsorção óssea. A glicose, principal fonte energética para diversos processos celulares, é crucial para a osteoclastogênese e para a manutenção dos osteoclastos ativos. No entanto, o papel das vias metabólicas da glicose nos osteoclastos ainda não foi bem elucidado. Sendo assim, com o intuito de explorar um ramo da via glicolítica, avaliamos o efeito da O-GlcNAcilação, que é uma modificação pós-traducional decorrente da metabolização de glicose pela via das hexosaminas. Este processo consiste na incorporação de (GlcNAc), em resíduos de serina/ treonina de proteínas nucleares e citoplasmáticas pela ação da enzima OGT. A O-GlcNAcilação regula diversos processos celulares incluindo fatores de transcrição, atividade enzimática, funções de proteínas nucleares e citoplasmáticas, dentre outros. Portanto, o objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel da O-GlcNAcilação na osteoclastogênese e na atividade dos osteoclastos in vitro e no remodelamento ósseo fisiológico e patológico in vivo. Para a cultura de osteoclastos, foram utilizadas a medula óssea de camundongos C57BL/6, tratadas com GlcNAc ou com os inibidores da OGT (OSMI-1 e 5SGlcNAc); assim como células da medula óssea de camundongos com deleção seletiva de Ogt em monócitos (LysM-Cre Ogt fl/fl ) e em osteoclastos (CtsK-Cre Ogt fl/fl ), com os seus respectivos controles LysM-Cre e CtsK-Cre. Da mesma forma, foi realizado cultura de osteoclastos humanos, onde foi observado o comportamento dos osteoclastos frente ao tratamento com GlcNAc e OSMI-1. Para a avaliação in vivo, utilizamos camundongos CtsK-Cre Ogt fl/fl e seu controle para a avaliação dos parâmetros ósseos e para a indução do modelo de lesão periapical. Primeiramente, foi observado que a adição de GlcNAc estimula a diferenciação e atividade dos osteoclastos murinos, enquanto o OSMI-1 e 5SGlcNAc inibiram esses efeitos. Paralelamente a isso, a deficiência de Ogt nos monócitos prejudicou a diferenciação dos osteoclastos e a capacidade de desmineralização deles, além de apresentarem uma menor expressão proteica de NFATc1, Integrina αV e Catepsina K durante todo o período de diferenciação. Ainda, vimos que o GlcNAc estimulou a diferenciação de osteoclastos de origem humano e estimulou os mesmos a reabsorverem de forma mais agressiva. Esse efeito também foi revertido na presença do OSMI-1. Extrapolando os nossos resultados in vitro, observamos que animais com deficiência seletiva de Ogt nos osteoclastos, não apresentaram uma reabsorção óssea fisiológica no fêmur observada após 16 semanas de idade, demonstrando um maior volume ósseo e espessura trabecular quando comparados com o grupo controle. O osso cortical do fêmur também apresentou um maior volume ósseo e uma menor porosidade nos animais CtsK-Cre Ogt fl/fl. Por fim, como um possível alvo de OGlcNAcilação temos o NFATc1, uma vez que ele estava mais expresso no núcleo na presença de GlcNAc. Esses dados mostram que a O-GlcNAcilação exerce um papel importante na osteoclastogênese murino e humano, além de alterar o comportamento reabsortivo dos osteoclastos para um modo mais agressivo. Por fim, nossos dados mostram um possível mecanismo para a perda e fragilidade óssea mediada pela atividade excessiva dos osteoclastos em doenças osteolíticas. Sendo assim, o presente estudo abre novos caminhos direcionados para a O-GlcNAcilação em osteoclastos como uma possível intervenção terapêutica em doenças osteometabólicas.

Osteoclasts play a key role in the regulation of bone mass, which to differentiate and reabsorb bone require high energy expenditure. Glucose, the main energy source for several cellular processes, is crucial for osteoclastogenesis and for the maintenance of active osteoclasts. However, the role of glucose metabolic pathways on osteoclasts has not been well elucidated. Therefore, in order to explore a branch of the glycolysis pathway, we evaluated the effect of O-GlcNAcylation, which is a post-translational modification resulting from glucose metabolism through the hexosamine pathway. This process consists of the addition of GlcNAc in serine/threonine moieties of nuclear and cytoplasmic by OGT enzyme. O-GlcNAcylation regulates several cellular processes including transcription factors, enzymatic activity, functions of nuclear and cytoplasmic proteins, among others. Therefore, the aim of our study was to evaluate the role of O-GlcNAcylation on osteoclastogenesis and osteoclast's activity in vitro, and on physiological and pathological bone remodeling in vivo. For osteoclast culture, we used bone marrow from C57BL/6 mice treated with GlcNAc or OGT inhibitors (OSMI-1 and 5SGlcNAc), and we also used bone marrow from Ogt genetic deletion in monocytes (LysM-Cre Ogt fl/fl ), and in osteoclasts (CtsK-Cre Ogt fl/fl ) mice, with their respective controls mice. To evaluate the osteoclasts' resorption behavior with GlcNAc and OSMI-1 treatment we used human cells for osteoclast culture. For in vivo analysis, we used CtsK-Cre Ogt fl/fl mice and CtsK-Cre as a control group to evaluate bone parameters and to induce the periapical lesion model. First, we observed that GlcNAc addition stimulates murine osteoclast's differentiation and activity, while OSMI-1 and 5SGlcNAc inhibited. Together, Ogt deficiency in monocytes impaired osteoclast's differentiation, and their demineralization capacity, showing a decrease in NFATc1, αV Integrin, and Cathepsin K protein expression during all osteoclast's differentiation process. Besides this, GlcNAc stimulates human osteoclast's differentiation and induces osteoclasts to resorb more aggressively. This effect was also reversed in the presence of OSMI-1. Going beyond our in vitro studies, we observed that Ogt deficiency mice in osteoclasts did not present physiological bone resorption in the femur after 16-weeks old, since these mice presented higher bone volume and trabecular thickness when compared with its control group. The femur cortical bone also presented a higher bone volume and less porosity in CtsK-Cre Ogt fl/fl mice. Finally, as a possible target of O-GlcNAcylation, we have NFATc1, since it was more expressed in the nucleus in the presence of GlcNAc. These data show that O-GlcNAcylation plays an important role in murine and human osteoclastogenesis, in addition to altering the resorption behavior of osteoclasts to a more aggressive mode. Finally, our data show a possible mechanism for bone loss and fragility mediated by excessive osteoclast activity in osteolytic diseases. Therefore, the present study opens new avenues for O-GlcNAcylation on osteoclasts as a possible therapeutic intervention on osteometabolic diseases.