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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.58.2010.tde-27082010-160945
Document
Author
Full name
Luciana Prado Maia
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2010
Supervisor
Committee
Bulle, Daniela Bazan Palioto (President)
Costa, Fernando de Oliveira
Oliveira, Paulo Tambasco de
Title in Portuguese
Avaliação in vitro de matriz dérmica acelular como arcabouço tridimensional para cultivo de fibroblastos gengivais
Keywords in Portuguese
Cultura de células
Engenharia de tecidos
Fibroblastos gengivais
Matriz dérmica acelular
Abstract in Portuguese
Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção do periodonto. Alloderm® (MDA) é um substituto alógeno muito utilizado e estudado em periodontia. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, se a MDA é uma matriz tridimensional adequada, através de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais e células neoplásicas; e, ainda, se os subprodutos da MDA influenciam o comportamento celular. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais de cão (FGC) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de, respectivamente, três indivíduos e três cães saudáveis. As células FGC, FGH e B16F10 de melanoma murino foram cultivadas sobre a MDA por até 14 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados: presença, morfologia e distribuição de FGC, FGH e B16F10 por fluorescência direta; viabilidade de FGC e FGH por MTT; e o efeito do meio de cultura condicionado (MC) em MDA por 24 h na viabilidade celular de FGC por MTT. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn para comparações múltiplas (nível de significância: 5%). Resultados: A epifluorescência revelou que, em 12 h, FGH e FGC estavam aderidos à superfície da MDA em baixa densidade celular, exibindo morfologia poligonal com núcleos esféricos, enquanto que, aos 7 e 14 dias, essas células apresentavam com formato alongado, núcleos ovalados e citoesqueleto de actina com fibras de estresse. Aos 7 e 14 dias, FGC apresentavam-se distribuídos de forma desigual sobre a MDA, formando uma camada celular descontínua, sem aumento no número de células entre os períodos; FGH formaram uma monocamada celular na superfície da MDA, estando presentes em maior número após 14 dias de cultivo (p<0,05); e B16F10 exibiram um aumento no número de células de 12 h para 7 dias (p<0,05), apresentando-se dispostas em aglomerados celulares, principalmente na superfície da MDA, com a formação de camada contínua aos 14 dias. Notou-se maior número de células nas amostras cultivadas com B16F10, seguido por FGH e FGC aos 7 dias (p<0,05). Aos 14 dias, FGH e B16F10 estavam presentes em maior número, com diferença estatística significante em relação aos FGC (p<0,05). Foi observada maior porcentagem de células na superfície (p<0,05) do que no interior da MDA e essa proporção manteve-se estável durante os períodos avaliados para todos os tipos celulares. O ensaio de MTT indicou maior viabilidade celular nas amostras cultivadas com FGH comparado a FGC (p=0,024), aos 7 e 14 dias. Notou-se um decréscimo na viabilidade celular em culturas cultivadas em MC, com diferença estatística entre os grupos em 48 e 72 horas (p<0,05). Conclusão: Podemos concluir que fibroblastos gengivais e mesmo células altamente proliferativas, como B16F10, povoam apenas superficialmente a MDA e que FGC são afetados negativamente pelos subprodutos da MDA, reduzindo sua viabilidade.
Title in English
In vitro evaluation of acellular dermal matrix as a three-dimensional scaffold for gingival fibroblasts seeding
Keywords in English
Acellular dermal matrix
Cell culture
Gingival fibroblasts
Tissue engineering
Abstract in English
Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Alloderm® (Alloderm® - ADM) is the most used and studied allogeneic substitute. The aim of this investigation was to verify if ADM is a suitable threedimensional matrix, through its in vitro response to gingival fibroblasts and cancerous cells lineage and, also, if ADM end products affect cellular behavior. Methods: Canine gingival fibroblasts (CGF) and human gingival fibroblasts (HGF) cultures were established by the explant technique of gingival connective tissues of three dogs and three healthy patients, respectively. CGF, HGF and B16F10 cells of murine melanoma were seeded on ADM and grown for up to 14 days. The following parameters were assessed: presence, morphology and distribution of CGF, HGF e B16F10 by direct fluorescence; CGF and HGF viability by MTT; and the effect of culture medium conditioned (CM) in the MDA for 24 h on CGF viability by MTT. Quantitative data were submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, followed by Dunn's method. Results: Epifluorescence revealed that CGF and HGF were adherent and exhibited a polygonal morphology at 12 h while at 7 and 14 days they were spread, exhibiting an elongated shape and the actin cytoskeleton assembled into stress fibers. CGF were unevenly distributed on ADM surface, showing no increase in cell number over the experimental periods; HGF formed a monolayer on the ADM surface, in a higher number at 14 days (p<0,05); B16F10 exhibited na increase in cell number in 7 days (p<0,05), and were mainly arranged in cell aggregates on the ADM, forming a continuous layer at 14 days. A higher percentage of cells on the ADM surface (p <0.05) compared to inside the matrix was observed for all cell types in all periods. MTT values indicated higher cell viability in samples cultured with HGF compared to CGF (p=0.024). A significantly lower cell viability for CGF grown in CM compared to cells grown in non conditioned medium at 48 and 72 h (p <0.05) was noticed. Conclusion: Gingival fibroblasts and even highly proliferative cells as B16F10 can be only superficially located on ADM and CGF are negatively affected by ADM end products, reducing its viability.
 
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me_luciana_maia.pdf (2.12 Mbytes)
Publishing Date
2010-11-08
 
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