Leishmania amazonensis é um protozoário que causa principalmente leishmaniose cutânea em humanos. O aminoácido arginina exerce papel central na sobrevivência do parasita no macrófago e no estabelecimento da infecção ao suprir ornitina, via arginase 1, precursor da via de poliaminas, que são moléculas essenciais para a proliferação do parasita. Por outro lado, arginina pode levar à produção de óxido nítrico (NO) via óxido nítrico sintase 2 (NOS2), principal molécula efetora leishmanicida. Ao contrário do que ocorre em macrófagos murinos, estudos apontam ausência de atividade de NOS2 em macrófagos humanos. Diversos trabalhos demonstraram a importância de microRNAs na regulação da resposta imune na infecção por diferentes espécies de Leishmania e hospedeiros. Neste estudo, investigamos a via de poliaminas/NO e regulações mediadas por miRNAs que alteram a infectividade de L. amazonensis em macrófagos humanos derivados da linhagem monocítica THP-1. Inicialmente, quantificamos o perfil de expressão de miRNAs envolvidos na resposta inflamatória e identificamos a modulação positiva de miRNAs pertencentes à família miR-372/373/520, que compartilham a sequência seed AAGUGCU, responsável pelo reconhecimento do mRNA alvo. Essa sequência é idêntica à seed do miR-294 murino, previamente demonstrado como um importante fator de promoção da infecção ao reduzir o mRNA Nos2. Estudos em colaboração demonstraram a regulação positiva desses miRNAs também em THP-1 infectada com L. braziliensis e L. infantum e em soro de pacientes com leishmaniose visceral. Nossos resultados mostraram que a infecção de L. amazonensis nocaute de arginase é reduzida após 24h e correlaciona com a ausência de regulação dos miRNAs estudados. Para entender a importância desses miRNAs na infecção por L. amazonensis, inibimos os miR-372, miR-373 e miR-520d sozinhos ou combinados e observamos que a inibição de miR-372, mas não miR-373 ou miR-520d sozinhos, foi capaz de reduzir a proporção de macrófagos infectados e o número de amastigotas por macrófagos. A inibição simultânea dos 3 miRNAs reduziu ainda mais a infecção, enquanto o uso de mímicos aumentou a infecção, indicando um mecanismo sinergístico dos miR-372/373/520d na promoção da infectividade. Esses miRNAs compartilham mRNAs-alvo putativos que codificam proteínas envolvidas na tomada de aminoácidos, metabolismo de poliaminas e ciclo da ureia, incluindo o principal transportador de arginina do macrófago CAT2, cujo mRNA é aumentado com a inibição simultânea dos miR-372/373/520d. Por outro lado, o sítio alvo de NOS2 de camundongos não é conservado no 3UTR de humanos. De forma geral, nossos resultados mostraram baixa modulação da via de NO/poliaminas a nível transcricional e, para acessar o fenótipo do macrófago, realizamos quantificação a nível de metabólitos utilizando metabolômica baseada em espectrometria de massas. Nossos dados mostraram que a infecção aumenta a produção de componentes do ciclo da ureia e putrescina, enquanto a inibição dos miR-372/373/520d reduz a produção de putrescina, espermina e tripanotiona. Nossos resultados evidenciam que a corregulação da família miR-372/373/520d na infecção por Leishmania atua na regulação de genes envolvidos no metabolismo de L-arginina, culminando na produção de poliaminas e favorecendo o estabelecimento e a manutenção da infecção. Os mecanismos moleculares descritos podem ser base para o desenvolvimento de terapias voltadas ao hospedeiro

Leishmania amazonensis is a protozoan that causes mainly cutaneous leishmaniasis in humans. The amino acid arginine exerts a central role in the parasite survival within the macrophages and in the establishment of que infection since it supplies ornithine via arginase 1 as a precursor metabolite of the polyamines pathway, that are essential molecules for the parasite proliferation. On the other hand, arginine can lead to nitric oxide (NO) production via nitric oxide synthase 2 (NOS2), the main effector leishmanicidal molecule. Different from what occurs in murine macrophages, there are studies pointing to the absence of NOS2 activity in human macrophages. Some studies show the importance of microRNAs in the regulation of immune response in the infection by different Leishmania and hosts species. In this study, we investigated the polyamines/NO pathway and miRNA-mediated regulations that change L. amazonensis infectivity in human macrophages derived from the monocytic cell line THP-1. Initially, we quantified the expression profile of miRNAs involved in the inflammatory response and we identified positive modulation of miRNAs from the miR-372/373/520 family, that share the seed sequence AAGUGCU, responsible for the recognition of the target mRNA. This sequence is identical to que murine miR-294s seed, previously demonstrated as an important factor promoting infection by reducing the mRNA Nos2. Studies in collaboration demonstrated positive regulation of those miRNAs also in THP-1 infected with L. braziliensis and L. infantum and in the serum of visceral leishmaniasis patients. Our results show that the infection by arginase knockout-L. amazonensis is reduced after 24h and correlates with the absence of regulation of the studied miRNAs. To understand the importance of those miRNAs in the infection by L. amazonensis, we inhibited the miR-372, miR-373 and the miR-520d either alone or in combination and observed that the inhibition of the miR-372, but not the miR-373 and miR-520d alone, was able to reduce the proportion of infected macrophages and the number of amastigotes per macrophage. The simultaneous inhibition of the 3 miRNAs reduced even further the infection, while the use of mimics increased the proportion of infected macrophages, indicating a synergistic mechanism of the miR-372/373/520d promoting infectivity. These miRNAs share putative target-mRNAs encoding proteins involved in the uptake of amino acids, polyamine metabolism and urea cycle, including the main arginine transporter in macrophages, CAT2, whose mRNA is increased with the simultaneous inhibition of the miR-372/373/520d. On the other hand, the target site of mice NOS2 is not conserved in humans. In general, our results showed low modulation of the NO/polyamines pathway at transcriptional level and, to access the macrophages phenotype, we quantified the metabolites levels using mass spectrometry-based metabolomics. Our data show that the infection increases production of urea cycle components and putrescine, while the inhibition of miR-372/373/520d reduces the production of putrescine, spermine and trypanothione. Our results evidence that the coregulation of the miR-372/373/520d family in the Leishmania infection acts in the regulation of genes involved in the L-arginine metabolism, culminating in the production of polyamines and favoring the establishment and maintaining the infection. The molecular mechanisms described could be the basis to the development of host-directed therapies