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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2022.tde-24042024-141952
Document
Auteur
Nom complet
Ruth Tamara Valencia Portillo
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2022
Directeur
Jury
Sanchez, Maria Carmen Arroyo (Président)
Cruz, Alda Maria da
Hiramoto, Roberto Mitsuyoshi
Romero, Gustavo Adolfo Sierra
 
Titre en portugais
Validação de teste imunoenzimático (ELISA) empregando antígeno recombinante Lb6H para o diagnóstico sorológico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
Mots-clés en portugais
Ensaio de imunoadsorção enzimática
Leishmania braziliensis
Leishmaniose cutânea
Leishmaniose mucocutânea
Proteínas recombinantes
Testes sorológicos
Resumé en portugais
O diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma questão em aberto em nosso meio, sendo premente a busca de uma solução. Exames laboratoriais são importantes no diagnóstico de LTA, pois as manifestações clínicas, embora muitas vezes sugestivas, não são patognomônicas, havendo necessidade de dados complementares indicativos da etiologia. Entre os exames laboratoriais disponíveis, até o momento, nenhum parece ter sensibilidade compatíveis para utilização na rotina diagnóstica. Os testes voltados ao encontro de parasitos em amostras provenientes de lesão são considerados teste padrão, mas a sensibilidade não é alta e os testes moleculares voltados à detecção de DNA de Leishmania carecem ainda de padronização entre os vários laboratórios. Neste cenário, surge a opção de exames laboratoriais indiretos que detectam a presença de resposta imune à Leishmania, exame sorológico ou teste de hipersensibilidade tardia. Entretanto, devido à baixa produção de anticorpos anti-Leishmania, os testes sorológicos têm sido pouco utilizados no diagnóstico da LTA. Por outro lado, a resposta imune celular é bem patente e é detectada por teste de Montenegro (hipersensibilidade tardia) e por isso utilizado na rotina clínica. No entanto, este não é mais realizado por descontinuidade na produção do antígeno, trazendo problemas ao diagnóstico de LTA. Visando à utilização no diagnóstico da LTA, foi validado teste sorológico, no formato ELISA, para pesquisa de anticorpos anti-IgG, utilizando três lotes do antígeno recombinante Lb6H, derivado da sequência de Leishmania (Viannia) braziliensis, com uma casuística de 1.091 amostras, distribuídas em quatro painéis. No painel de referência (painel 1), composto por 70 amostras de pacientes com as formas cutânea e mucosa e 70 controles sadios, o teste apresentou sensibilidade de 100,0% (IC95%: 94,8-100,0), 95,7% (IC95%: 88,1-98,8) e 98,6% (IC95%: 92,3-99,9) e especificidade de 100,0% (IC95%: 94,8-100,0), 97,1% (IC95%: 90,2-99,5) e 100,0% (IC95%: 94,8-100,0), respectivamente para os lotes A, B e C. O ensaio mostrou-se reprodutível, com coeficiente de variação das amostras positivas 12,73 na repetibilidade, 28,86 na reprodutibilidade e 9,05 na homogeneidade. Na avaliação da estabilidade do antígeno na placa com o tempo, as placas sensibilizadas com o antígeno recombinante mostraram-se estáveis a -20oC e 4oC, por 180 dias e o estudo da estabilidade acelerada (37oC) indicou validade de 12 meses, sem perda de reatividade. Em amostras de pacientes com LTA, provenientes de cinco centros de pesquisa e/ou assistência (painel 2), o teste padronizado apresentou sensibilidade de 79,1% (IC95%: 74,8-82,9), 79,9% (IC95%: 75,6-83,6) e 84,0% (IC95%: 80,0-87,3), respectivamente para os lotes A, B e C. Em amostras de controles sadios, provenientes de quatro áreas com diferentes endemicidades (painel 3), obteve-se especificidade de 75,6% (IC95%: 71,0-80,0); 73,7% (IC95%: 69,0-78,0) e 92,4% (IC95%: 89,2-94,7), respectivamente para os lotes A, B e C. No estudo da reatividade cruzada (painel 4), resultados positivos foram obtidos em 14,5% (IC95%: 9,8-20,7) das amostras de outras doenças com o lote A e 13,9% (IC95%: 9,3-20,0) com os lotes B e C. Com base no bom desempenho diagnóstico e nas características de reprodutibilidade e estabilidade do antígeno, sugere-se a utilização de rLb6H no diagnóstico da LTA
 
Titre en anglais
Validation of enzyme immunoassay (ELISA) using recombinant Lb6H antigen for the serological diagnosis of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL)
Mots-clés en anglais
Enzyme-linked immunosorbent assay
Leishmania braziliensis
Leishmaniasis cutaneous
Leishmaniasis mucocutaneous
Recombinant proteins
Serological tests
Resumé en anglais
The American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) diagnosis is an open question in our country, and the search for a solution is urgent. Laboratory tests are essential in diagnosing ATL, as the clinical manifestations, although often suggestive, are not pathognomonic, requiring complementary data indicative of the etiology. Among the laboratory tests available to date, none seems to have compatible sensitivity for use in routine diagnosis. Tests aimed at finding parasites in samples from lesions are considered a standard test, but the sensitivity is not high, and molecular tests aimed at detecting Leishmania DNA still lack standardization among the various laboratories. In this scenario, there is the option of indirect laboratory tests that detect the presence of an immune response to Leishmania, serological examination, or delayed hypersensitivity test. However, due to the low production of anti-Leishmania antibodies, serological tests have been used little in diagnosing ACL. On the other hand, the cellular immune response is quite evident and is detected by the Montenegro test (delayed hypersensitivity) and is therefore used in clinical routine. However, this is no longer performed due to discontinuity in the antigen production, bringing problems to the diagnosis of ACL. Therefore, aiming to be used in the diagnosis of ACL, a serological test was validated, in ELISA format, for the investigation of anti-IgG antibodies, using three batches of the recombinant antigen Lb6H, derived from the Leishmania (Viannia) braziliensis sequence, with a series of 1,091 samples, divided into four panels. In the reference panel (panel 1), composed of 70 samples from patients with the cutaneous and mucosal forms and 70 healthy controls, the test showed a sensitivity of 100.0% (95%CI: 94.8-100.0), 95.7% (95%CI: 88.1-98.8) and 98.6% (95%CI: 92.3-99.9), and a specificity of 100.0% (95%CI: 94.8-100.0), 97.1% (95%CI: 90.2-99.5) and 100.0% (95%CI: 94.8-100.0), respectively for batches A, B and C. The assay proved to be reproducible, with a coefficient of variation of positive samples 12.73 for repeatability, 28.86 for reproducibility, and 9.05 for homogeneity. In evaluating the stability of the antigen on the plate with time, the plates sensitized with the recombinant antigen were stable at 4oC and -20oC for 180 days, and the accelerated stability study (37ºC) indicated the validity of 12 months, without loss of reactivity. In samples of patients with ACL from five research and care centers (panel 2), the standardized test showed a sensitivity of 79.1% (95%CI: 74.8-82.9), 79.9% (95%CI: 75.6-83.6), and 84.0% (95%CI: 80.0-87.3), respectively for batches A, B, and C. In samples of healthy controls, from four areas with different endemicities (panel 3), specificity of 75.6% (95%CI: 71.0-80.0); 73.7% (95%CI: 69.0-78.0) and 92.4% (95%CI: 89.2-94.7) was obtained, respectively for batches A, B, and C. In the cross-reactivity study (panel 4), positive results were obtained in 14.5% (95%CI: 9.8-20.7) of the samples of other diseases with batch A and 13.9% (95%CI: 9.3-20.0) with batches B and C. Based on the good diagnostic performance and the reproducibility and stability characteristics of the antigen, we suggest using rLb6H in the diagnosis of ATL
 
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Date de Publication
2024-04-24
 
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  • VALENCIA PORTILLO, Ruth Tamara. Validação de teste imunoenzimático (ELISA) empregando antígeno recombinante Lb6H para o diagnóstico sorológico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). 2022. Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Saúde Internacional) - Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2022. Acesso em: 2024-10-03.

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