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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.5.2014.tde-25022015-085731
Document
Author
Full name
Andresa Forte
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2014
Supervisor
Committee
Bydlowski, Sergio Paulo (President)
Isaac, Cesar
Lima, Thais Martins de
Title in Portuguese
Expansão ex vivo das células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical: análise comparativa da proliferação celular em cocultura de células-troco mesenquimais provenientes do endotélio vascular do cordão umbilical e do tecido adiposo
Keywords in Portuguese
Células progenitoras hematopoiéticas
Células-tronco
Células-tronco adultas
Cordão umbilical
Proliferação de células
Sangue fetal
Tecido adiposo
Técnicas de cocultura
Abstract in Portuguese
INTRODUÇÃO: As células-tronco hematopoiéticas (CTH) do sangue do cordão umbilical (SCU) têm sido utilizadas com sucesso para o tratamento de doenças malignas e não malignas. No entanto, algumas unidades de SCU podem apresentar baixa quantidade de células nucleadas totais (CNT). Algumas abordagens têm sido sugeridas para evitar problemas em relação à baixa concentração de CTH no transplante, como a administração de duas unidades de SCU para o paciente e a expansão ex vivo de CTH. OBJETIVO: Avaliar as taxas de proliferação celular na expansão ex vivo do SCU em sistema de cocultura com células-tronco mesenquimais (CTM) obtidos a partir de diferentes fontes com alta e baixa confluência e adicionando-se ou não coquetel de citocinas no meio de cultura. MÉTODOS: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. A coleta do SCU (n =10) foi realizada após o nascimento do bebê e expulsão da placenta. O processamento foi realizado utilizando o método de redução de volume, o qual consiste em depleção de eritrócitos. As amostras de CTM provenientes do endotélio vascular do cordão umbilical foram obtidas de doadores diferentes (n=3) e o tecido adiposo (n=3) do inventário do LIM-31. A expansão das CNT e das células com expressão de marcadores CD133+/CD34+ foram observados depois de sete dias de cultura. Além disso, o ensaio para análise de unidades de formadoras de colônias (UFC) foi realizado em todas as amostras antes e depois da expansão do SCU. Para a expansão em sistema de cocultura foi separado dois grupos para ambas as fontes de CTM (Grupo I - cocultura com adição de coquetel de citocinas vs. Grupo II - cocultura sem citocinas). RESULTADOS: Após sete dias, no grupo I com cocultura confluente, a taxa de proliferação de CNT foi duas vezes maior ao comparar com cocultura subconfluente (35 vs. 16 vezes). No mesmo grupo também foi possível evidenciar elevada taxa de proliferação de células CD133+/CD34+. O índice de proliferação das UFC no grupo I aumentou até oito vezes. A cocultura subconfluente tanto do endotélio vascular do cordão umbilical como do tecido adiposo apresentou menor rendimento em comparação as CTM confluentes. A expansão das células na presença de citocinas apresentou maior proliferação celular ao comparar às coculturas sem adição de citocinas. CONCLUSÃO: Este estudo mostrou que para alto rendimento de células do SCU, o sistema de cocultura requer adição de coquetel de citocinas e CTM confluente independentemente da fonte utilizada
Title in English
Cord blood hematopoietic stem cells ex vivo expansion: comparative analysis of cell proliferation promoted by adipose tissue and umbilical cord endothelium mesenchymal stem cells in coculture system
Keywords in English
Adipose tissue
Adult stem cells
Cell proliferation
Coculture techniques
Fetal blood
Hematopoietic progenitor cells
Stem cells
Umbilical cord
Abstract in English
INTRODUCTION: Umbilical cord blood (UCB) hematopoietic stem cells have been successfully used for the treatment of both malignant and non-malignant diseases. Nevertheless, some UCB units could have low total nucleated cells (TNC) dose. Several approaches have been suggested to avoid inadequacy problems of hematopoietic stem cells (HSC) number for transplantation, such as administration of two UCB units to the patient and HSC ex vivo expansion. OBJECTIVE: Evaluate UCB ex vivo expansion proliferative rates in a high and low mesenchymal stem cells (MSC) confluence feeder layer obtained from different MSC sources and by adding or not cytokines cocktail into the medium. METHODS: This study was approved by the Research Ethic Committee (CAPPESQ) of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. The collection of UCB (n=10) was made after delivery of the infant and the expulsion of placenta. Processing was performed using volume reduction method which consists in red blood depletion. MSC samples from umbilical cord endothelium were obtained from three different donors and adipose tissue (n=3) obtained from LIM31's pattern inventory. The total nucleated cell (TNC), expression of hematopoietic surface markers such as CD133+/CD34+ were observed after seven days of culture. Beyond that, colony forming unit assay (CFU) was performed before and after UCB expansion. The expansion by coculture method was observed in two groups (Group I - coculture with cytokines cocktail added vs. Group II- coculture without cytokines cocktail) for both MSCs sources. RESULTS: After seven days, analysis of confluent coculture showed that TNC proliferation rate ware almost 2 times higher than in subconfluent coculture (35 vs. 16-fold) in Group I and also revealed higher proliferative rate in CD133+/CD34+ cells considering. CFU showed similar increase after seven days of culture in comparison of day 0 (up to 8-fold). Subconfluent coculture for both umbilical cord endothelium and adipose tissue showed lower yield compared with those with high MSC confluence. The expansion in the presence of cytokines showed higher cell proliferation compared to the cocultures without addition of cytokines. CONCLUSION: This study showed that coculture system may require the addition of cytokines cocktail in the media and confluent MSC regardless of source for high yield of UCB cells
 
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AndresaForte.pdf (2.00 Mbytes)
Publishing Date
2015-02-25
 
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