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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2021.tde-10112021-164626
Document
Author
Full name
Jean Carlos dos Santos da Luz
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2021
Supervisor
Title in Portuguese
Eletrogeneterapia com IFN-Beta em modelo murino de melanoma
Abstract in Portuguese
A eficácia de determinadas moléculas terapêuticas com ações intracelulares pode ser comprometida pela incapacidade destas em ultrapassar a membrana celular ou pela curta permanência das mesmas em seu sítio de ação, criando a necessidade do uso de altas doses ou reaplicações, que podem gerar toxicidade. Na terapia oncológica, citocinas administradas de forma sistêmica requerem altas doses para uma eficaz atividade antitumoral, o que frequentemente acarreta severos efeitos colaterais. A eletrotransfecção gênica (GET) é uma técnica que combina o uso de plasmídeos com a eletroporação (ou eletropermeabilização), um método que facilita o transporte de moléculas externas para o interior das células por meio de pulsos elétricos permeabilizantes da membrana celular. A técnica possibilita a expressão de citocinas de forma local e prolongada, evitando efeitos colaterais sistêmicos. Na oncologia, o uso de plasmídeos codificantes de citocinas visa modular o microambiente tumoral, objetivando gerar uma resposta imunológica antitumoral local, sistêmica e de memória. Atualmente, plasmídeos codificantes de interleucina-12 (IL-12) são os mais amplamente utilizados em GET tanto como monoterapia ou em combinação com outras terapias e têm apresentado resultados promissores, entretanto, a IL-12 tem suas ações limitadas à um repertório restrito de células com receptores para tal citocina. Neste trabalho, foi proposto o uso de interferon- (IFN-Beta) como molécula imunomoduladora, visto sua ampla variedade de atividades antitumorais e presença de receptores IFNAR em todas as células nucleadas. O presente projeto teve como objetivos estabelecer o protocolo elétrico para eletrotransfecção de plasmídeos em linhagem celular de melanoma murino (B16F10) in vitro e avaliar as atividades antitumorais do tratamento proposto, bem como uma avaliação preliminar para o uso do IFN-Beta murino GET in vivo. Como resultados, o protocolo de eletrotransfecção estabelecido para a linhagem B16F10 resultou em uma taxa de eletrotransfecção de plasmídeo codificante de eGFP de até 45,6% com viabilidade próxima a 100%. Além disso, a eletrotransfecção de plasmídeo codificante de IFN-Beta resultou no acúmulo da proteína no sobrenadante em até 526,1pg/mL, e retardo no crescimento celular de até 66% em comparação com as células controles. Em ensaio preliminar in vivo, foi detectado o sinal de eGFP após GET em tumores subcutâneos. Este estudo abre o caminho para investigações mais aprofundadas do tratamento utilizando GET e a possível resposta imunológica antitumoral provocada pela IFN-Beta
Title in English
Electrogenetherapy with IFN-Beta in a murine model of melanoma
Abstract in English
The efficacy of certain therapeutic molecules with intracellular actions may be compromised by their inability to cross the cell membrane or by their short retention in their site of action, creating the need for the use of high doses or reapplications, which can generate toxicity. In cancer therapy, cytokines administered systemically require high doses for an effective antitumor activity, which often causes severe side effects. Gene electrotransfer (GET) is a technique that combines the use of plasmids with electroporation (or electropermeabilization), a method that facilitates the transport of external molecules into cells by using electrical pulses to permeabilize the cell membrane. This technique allows the expression of cytokines in a local and prolonged way, avoiding systemic side effects. In oncology, the use of plasmids encoding cytokines aims to modulate the tumor microenvironment, seeking to generate a local, systemic and memory antitumor immune response. Currently, plasmids encoding interleukin-12 (IL-12) are the most widely used in GET either as monotherapy or in combination with other therapies and have shown promising results, however, IL-12 targets a restricted repertoire of cells with receptors for that cytokine. In this work, the use of interferon- (IFN-Beta) as an immunomodulatory molecule was proposed, given its wide variety of antitumor activities and the presence of IFNAR receptors in all nucleated cells. This project aimed to establish the electrical protocol for electrotransfection of plasmids in a murine melanoma cell line (B16F10) in vitro and to evaluate the antitumor activities of the proposed treatment, as well as a preliminary evaluation for the use of murine IFN-Beta GET in vivo. As a result, the electrotransfection protocol established for the B16F10 cell line using an eGFP-encoding plasmid yielded an electrotransfection rate of up to 45.6% with viability close to 100%. Furthermore, electrotransfection of an IFN-Beta encoding plasmid resulted in accumulation of the protein in the supernatant of up to 526.1pg/mL, and reduction in cell growth of up to 66% compared to control cells. In a preliminary in vivo assay, the eGFP signal was detected after GET in subcutaneous tumors. This study paves the way for further investigations of treatment using GET and the possible anti-tumor immune response elicited by IFN-Beta
 
Publishing Date
2021-11-10
 
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