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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2020.tde-31102020-185717
Document
Auteur
Nom complet
Juliano Zequini Polidoro
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2020
Directeur
Jury
Girardi, Adriana Castello Costa (Président)
Chaves, Maria Luiza Morais Barreto de
Luchi, Weverton Machado
Seguro, Antonio Carlos
Titre en portugais
A proteína associada a AT1R (ATRAP) atenua a inibição de ROMK mediada por angiotensina II em células de duto coletor
Mots-clés en portugais
Angiotensina II
Canais iônicos
Homeostase
Potássio
Receptores de angiotensina
Transdução de sinais
Resumé en portugais
A regulação da excreção renal de K+ constitui um mecanismo fundamental para a homeostase desse íon em longo prazo. Os canais ROMK representam o principal componente de secreção de K+ em situações basais, de modo que sua inibição contribui para a conservação de K+ em situações de carência do íon, condição comum nas dietas ocidentais modernas. A ativação de AT1R por angiotensina II (AngII) é sabidamente um mecanismo capaz de inibir ROMK, ao ativar estresse oxidativo e a expressão de c-Src total e c-Src fosforilada em dutos coletores. Vários trabalhos indicam que a sinalização de AT1R também é regulada por proteínas associadas, entre as quais a proteína associada a AT1R (ATRAP). O presente trabalho buscou analisar o impacto da proteína ATRAP sobre a regulação de ROMK por AngII. Para tanto, a proteína ATRAP, ou a proteína controle Beta-galactosidase (LacZ), foram super-expressas em células M-1, uma linhagem modelo de duto coletor cortical, sendo então a atividade de ROMK analisada por meio de um ensaio fluorescente desenvolvido recentemente. Além disso, possíveis mecanismos de sinalização subjacentes a tal regulação foram então analisados. O tratamento com 10-10M de AngII por 40min induziu uma inibição significativa de ROMK nas células super-expressando LacZ, mas não nas células super-expressando ATRAP. Essa resposta diferencial era acompanhada de uma menor fosforilação de c-Src. A menor fosforilação de c-Src nas células super-expressando ATRAP foi observada também em condições basais, na ausência de AngII, o que sugere que ATRAP afeta não apenas a indução de c-Src por AngII, mas também inibe a cinase de modo independente do agonista. Por fim, não houve alterações na expressão total de ROMK por estímulo prolongado (16-18h) com 10-7M AngII ou por super-expressão de ATRAP. Em conjunto, os dados indicam, portanto, que ATRAP atenua o efeito inibitório de AngII sobre ROMK em células de duto coletor, o que poderia ser explicado, ao menos em parte, por uma menor ativação de c-Src
Titre en anglais
AT1R-associated protein (ATRAP) attenuates angiotensin II-mediated inhibition of ROMK channels in collecting duct cells
Mots-clés en anglais
Angiotensin II
Homeostasis
Ion channels
Potassium
Receptors angiotensin
Signal transduction
Resumé en anglais
Adjustments in K+ excretion are essential for long-term K+ homeostasis. ROMK channel constitute the major K+ secretory route during basal conditions, in such a way that its inhibition contribute to K+ conservation during poor-K+ diets, which is the case of modern western diets. AT1R activation by angiotensin II (AngII) is well known to inhibit ROMK, by inducing oxidative stress and total and phosphorylated c-Src in collecting ducts. A number of studies have pointed out that AT1R signaling is also regulated by interacting proteins, particularly the AT1R-associated protein (ATRAP). The present study aimed to assess the impact of ATRAP over AngII-mediated ROMK modulation. After overexpressing ATRAP, or the control Beta-galactosidase (LacZ) protein, in a collecting duct model line (M-1 cells), ROMK activity was assessed by a novel fluorescent microplate assay. Moreover, possible underlying molecular mechanisms were also assessed. Treatment with 10-10M AngII for 40 minutes induced a significant inhibition in LacZ-overexpressing cells, but not in ATRAP-overexpressing cells. Accordingly, this differential effect was accompanied by lower levels of phosphorylated c-Src kinase in ATRAP-overexpressing cells. Such decrease in phospho-c-Src levels were also observed in vehicle-treated ATRAP-overexpressing cells, which suggests that ATRAP not only inhibits c-Src induction by AngII, but also downregulates c-Src by an agonist-independent mechanism. Finally, ATRAP overexpression or prolonged incubation (16-18h) with 10-7M AngII did not significantly change total ROMK expression. Collectively, our data supports that ATRAP attenuates ROMK inhibition mediated by AngII, at least in part, due to a downregulation of regulatory c-Src kinase
 
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Date de Publication
2020-10-31
 
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