A regulação da excreção renal de K+ constitui um mecanismo fundamental para a homeostase desse íon em longo prazo. Os canais ROMK representam o principal componente de secreção de K+ em situações basais, de modo que sua inibição contribui para a conservação de K+ em situações de carência do íon, condição comum nas dietas ocidentais modernas. A ativação de AT1R por angiotensina II (AngII) é sabidamente um mecanismo capaz de inibir ROMK, ao ativar estresse oxidativo e a expressão de c-Src total e c-Src fosforilada em dutos coletores. Vários trabalhos indicam que a sinalização de AT1R também é regulada por proteínas associadas, entre as quais a proteína associada a AT1R (ATRAP). O presente trabalho buscou analisar o impacto da proteína ATRAP sobre a regulação de ROMK por AngII. Para tanto, a proteína ATRAP, ou a proteína controle Beta-galactosidase (LacZ), foram super-expressas em células M-1, uma linhagem modelo de duto coletor cortical, sendo então a atividade de ROMK analisada por meio de um ensaio fluorescente desenvolvido recentemente. Além disso, possíveis mecanismos de sinalização subjacentes a tal regulação foram então analisados. O tratamento com 10-10M de AngII por 40min induziu uma inibição significativa de ROMK nas células super-expressando LacZ, mas não nas células super-expressando ATRAP. Essa resposta diferencial era acompanhada de uma menor fosforilação de c-Src. A menor fosforilação de c-Src nas células super-expressando ATRAP foi observada também em condições basais, na ausência de AngII, o que sugere que ATRAP afeta não apenas a indução de c-Src por AngII, mas também inibe a cinase de modo independente do agonista. Por fim, não houve alterações na expressão total de ROMK por estímulo prolongado (16-18h) com 10-7M AngII ou por super-expressão de ATRAP. Em conjunto, os dados indicam, portanto, que ATRAP atenua o efeito inibitório de AngII sobre ROMK em células de duto coletor, o que poderia ser explicado, ao menos em parte, por uma menor ativação de c-Src

Adjustments in K+ excretion are essential for long-term K+ homeostasis. ROMK channel constitute the major K+ secretory route during basal conditions, in such a way that its inhibition contribute to K+ conservation during poor-K+ diets, which is the case of modern western diets. AT1R activation by angiotensin II (AngII) is well known to inhibit ROMK, by inducing oxidative stress and total and phosphorylated c-Src in collecting ducts. A number of studies have pointed out that AT1R signaling is also regulated by interacting proteins, particularly the AT1R-associated protein (ATRAP). The present study aimed to assess the impact of ATRAP over AngII-mediated ROMK modulation. After overexpressing ATRAP, or the control Beta-galactosidase (LacZ) protein, in a collecting duct model line (M-1 cells), ROMK activity was assessed by a novel fluorescent microplate assay. Moreover, possible underlying molecular mechanisms were also assessed. Treatment with 10-10M AngII for 40 minutes induced a significant inhibition in LacZ-overexpressing cells, but not in ATRAP-overexpressing cells. Accordingly, this differential effect was accompanied by lower levels of phosphorylated c-Src kinase in ATRAP-overexpressing cells. Such decrease in phospho-c-Src levels were also observed in vehicle-treated ATRAP-overexpressing cells, which suggests that ATRAP not only inhibits c-Src induction by AngII, but also downregulates c-Src by an agonist-independent mechanism. Finally, ATRAP overexpression or prolonged incubation (16-18h) with 10-7M AngII did not significantly change total ROMK expression. Collectively, our data supports that ATRAP attenuates ROMK inhibition mediated by AngII, at least in part, due to a downregulation of regulatory c-Src kinase