O melanoma é classificado como o tipo mais agressivo do câncer de pele. A terapia alvodirigida combinada, com inibidores de BRAF e MEK, considerada a opção terapêutica padrão para o tratamento de pacientes em estágios avançados que possuem mutação em BRAF, resulta em uma taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 20%. A transferência de informações via Vesículas Extracelulares (VEs) tem sido descrita como um dos mecanismos capazes de modular os processos de resistência e progressão maligna. No melanoma, a presença de moléculas antitumorais em VEs está associada a maiores taxas de resposta ao tratamento e melhores prognósticos. O miR-195, considerado um supressor tumoral, é down-regulado em melanomas e sua superexpressão resulta na diminuição da proliferação celular e aumento da sensibilidade à quimioterapia com agentes alquilantes e inibidores de BRAF. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da superexpressão de miR-195 na carga de VEs liberadas por células de melanoma e o papel destas partículas na regulação da sensibilidade de células naive a terapia alvo-dirigida combinada. Diferentes linhagens de melanoma humano (A375, SKMel-05, SKMel-28 e UACC-62) foram transfectadas com o miR-195, resultando no aumento da concentração de VEs liberadas, as quais apresentaram menor tamanho em relação ao controle. Análises de expressão gênica por RT-qPCR mostraram que a transfecção de miR-195 induz o aumento da expressão de GTPases envolvidas na biogênese de exosomos, enquanto genes envolvidos na produção de microvesículas têm sua expressão diminuída. VEs secretadas por células transfectadas com este miRNA foram capazes de transferir seu efeito citostático, induzindo a expressão de genes antiproliferativos, como CDKN1A e CDKN3, e diminuindo a Página | 2 expressão de genes pró-proliferativos, como CCND1 e YAP1, em células naive. VEs contendo miR-195 também impactaram o crescimento tumoral in vivo, diminuindo a cinética de crescimento dos tumores. Além disso, o tratamento com VEs miR-195 foi capaz de aumentar a sensibilidade de células naive a terapia alvo-dirigida combinada, resultando em maior expressão de BAD, menor expressão de BCL2L1 e consequentemente maior porcentagem de morte celular, além da diminuição do potencial clonogênico das células. Adicionalmente, com relação ao mecanismo de regulação de miR-195, dados do TCGA mostraram maiores níveis de metilação deste miRNA em melanomas em relação a tecidos saudáveis, entretanto, sua expressão foi restaurada após o tratamento das células com Azacitidina em apenas uma das três linhagens testadas. Análises in silico mostraram que diversos lncRNAs capazes de inibir miR195 encontram-se superexpressos em melanoma, representando outro possível mecanismo de down-regulação. Em resumo, a superexpressão de miR-195 representa uma estratégia promissora para sensibilizar células de melanoma a terapia via transferência horizontal de informação

Melanoma is considered the most aggressive form of skin cancer. Combined targeted therapy, with BRAF and MEK inhibitors, considered the standard treatment for BRAF-mutated metastatic melanoma patients, results in 5 years overall survival of 20%. Extracellular Vesicles (EVs)-mediated transfer of information has been reported as a mechanism capable of regulating tumor resistance and progress. The presence of antitumoral molecules within EVs is related to increased response rates and better prognosis for melanoma patients. MiR-195, considered a tumor suppressor miRNA, is down-regulated in melanoma and its overexpression results in decreased cells proliferation and increased sensitivity to chemotherapy with alkylating agents and BRAF inhibitors. We aimed to analyze whether miR-195 overexpression could modulate EVs cargo and the role of these particles in naïve cells response to combined targeted treatment. A375, SKMel-5, SKMel-28 and UACC-62 cells were transfected with miR-195, resulting in increased EVs release and decreased EVs size. Gene expression analysis by RT-qPCR showed that miR-195 mimic induces the expression of GTAPases involved in exosomes biogenesis, while genes involved in microvesicles shedding are down-regulated upon transfection. EVs derived from cells overexpressing miR-195 could transfer its cytostatic effect, inducing the expression of anti-proliferative genes, such as CDKN1A and CDKN3, and inhibiting proproliferative genes, including CCND1 and YAP1, in naïve cells. EVs containing miR-195 also impaired in vivo tumor growth, reducing tumors growth kinetics. Treatment with miR-195 EVs could also sensitize naive cells to combined targeted therapy, resulting in higher expression of BAD, inhibition of BCL2L1 and consequently increased cell death, in addition to decreased Página | 4 clonogenic potential. Additionally, regarding the mechanisms of miR-195 regulation, TCGA data showed higher levels of methylation of this miRNA in melanoma tissues compared to controls, nevertheless, treatment of melanoma cells with Azacitidine only restored miR-195 expression in one out of three cell lines. In silico analysis showed that several lncRNAs capable to sponge miR-195 are overexpressed in melanomas, representing another possible mechanism of down-regulation. In summary, miR-195 overexpression represents a promising strategy to sensitize melanoma cells through horizontal transfer of information