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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2020.tde-28102020-163337
Documento
Autor
Nombre completo
Emily Montosa Nunes
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2020
Director
Tribunal
Vettorazzo, Laura Cristina Sichero (Presidente)
Lepique, Ana Paula
Lotufo, Leticia Veras Costa
Rangel, Maria Cristina Rodrigues
Título en portugués
Propriedades biológicas e bioquímicas de variantes naturais de HPV-18
Palabras clave en portugués
Neoplasias do colo do útero
Papilomavírus humano 18
Proteínas oncogênicas virais
Transformação celular neoplásica
Transformação celular viral
Vírus oncogênicos
Resumen en portugués
As infecções por HPV-16 e HPV-18 estão fortemente associadas ao risco de desenvolvimento de câncer cervical. Em todo o mundo, o HPV-16 é o tipo mais prevalente em carcinomas escamosos invasivos do colo do útero, seguido de HPV-18, o qual é similarmente prevalentes nos casos de adenocarcinoma. A variabilidade nucleotídica intra-típica de HPV-18 tem sido estudada resultando em importantes achados no que concerne à filogenia e evolução do vírus e a história natural das infecções. Embora os estudos acerca da relevância clínica da variabilidade genética de HPV-18 são limitados, sugeriu-se que variantes Ameríndias (As+AI) e Européias (E) representem isolados com um maior potencial oncogênico, quando comparadas às variantes Africanas (Af). Ademais, foi observado que variantes Af de HPV-18 são exclusivamente detectadas nas amostras de carcinoma escamoso invasivo do colo do útero, ao passo que variantes E e As+AI são mais prevalentes em adenocarcinoma e carcinoma adenoescamoso. No que concerne às diferenças biológicas entre as variantes de HPV-18, é fundamental ressaltar que há poucos estudos conduzidos até o momento e estes exploraram somente a variabilidade da oncoproteína viral E6, sendo que nenhum dos estudos foi realizado em modelos de células hospedeiras naturais de HPV-18, que são queratinócitos humanos primários (PHK). Pelo exposto, nós caracterizamos funcionalmente PHKs imortalizados por duas variantes distintas de HPV-18. Os PHKs foram transduzidos com E6/E7 das variantes As+AI e Af de HPV-18 (PHK18AA e PHK18Af, respectivamente) e subcultivados até p30, quando estes foram considerados imortalizados. Os PHK18AA atingiram à imortalização significativamente mais rápido do que os PHK18Af, ainda que uma "crise" não fosse observada em nenhum dos PHKs transduzidos. No entanto, não houve diferença nas taxas de proliferação entre os PHK18AA e PHK18Af em p30. Contudo, os PHK18AA imortalizados foram mais eficientes em formar colônias e esferoides em monocamada e cultura tridimensional, respectivamente, em experimentos diversos. Ademais, os PHK18AA imortalizados apresentaram uma maior eficiência em invadir através de uma matriz de colágeno, ainda que diferenças na migração não fossem observadas entre as variantes. Nós também observamos que células primárias de rim de ratos neonatos (BRK) co-transfectadas com E7 Af e RAS geraram um menor número de colônias, o que pode estar associado em parte à incapacidade de E7 Af em formar um complexo com a ubiquitina ligase UBR4 e degradar a proteína supressora tumoral PTPN14. Por outro lado, os PHK18Af imortalizados apresentaram maior resistência à diferenciação em meio enriquecido com soro e cálcio. Finalmente, culturas organotípicas derivadas dos PHKs imortalizados por ambas as variantes de HPV-18 eram semelhantes na morfologia e apresentaram níveis equivalentes de proteínas associadas à diferenciação e proliferação celular. Em conjunto, nossos dados indicam que a variante As+AI de HPV-18 tem um maior potencial oncogênico em comparação à variante Af, além das variantes interagirem diferentemente com alguns alvos celulares. Este estudo é único em analisar as propriedades bioquímicas e biológicas das oncoproteínas E6/E7 de variantes naturais HPV-18 no contexto do hospedeiro natural, isto é, as células epiteliais
Título en inglés
Biological and biochemical properties of natural variants of HPV-18
Palabras clave en inglés
Cell transformation neoplastic
Cell transformation viral
Oncogene proteins viral
Oncogenic viruses
Papillomavirus humano 18
Uterine cervical neoplasms
Resumen en inglés
HPV-16 and HPV-18 infections are strongly associated with the risk of developing cervical cancer. Worldwide, HPV-16 type is the most prevalent type in invasive squamous cell carcinomas of the cervix followed by HPV-18, whereas both viral types are similarly prevalent in adenocarcinoma cases. HPV-18 intratypic nucleotide variability has been studied resulting in important findings concerning the evolution and phylogeny of the virus and the natural history of infections. Although the studies about the clinical relevance of HPV-18 genetic variability are very limited, overall, it is suggested that Amerindian (As+AI) and European (E) variants represent isolates with a higher oncogenic potential compared to the African (Af) variants. Furthermore, it was observed that HPV-18 Af variants are exclusively detected in samples of invasive squamous cell carcinoma of the cervix, whereas As+AI and E variants are more prevalent in adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinoma. With regard to biological differences among HPV-18 variants, it is crucial to emphasize that the few studies conducted so far explored only the variability of the viral E6 oncoprotein, and most importantly, none of the studies was performed in HPV-18 natural host cell models, which are primary human keratinocytes (PHK). For these reasons, we characterized functionally PHKs immortalized by two different variants of HPV-18. PHKs were transduced with E6/E7 of HPV-18 As+AI and Af variants (PHK18AA and PHK18Af, respectively), and subcultured until p30, when these were considered immortalized. PHK18AA reached immortalization significantly faster than PHK18Af, even though a "crisis" was not observed in any of the transduced PHKs. Nevertheless, there were not proliferation rates difference among PHK18AA e PHK18Af at p30. However, immortalized PHK18AA were more efficient in forming colonies and spheroids in monolayer and three-dimensional cultures, respectively, using different assays. In addition, immortalized PHK18AA showed greater efficiency in invading through a collagen matrix, although no differences in migration were observed among variants. We also observed that baby rat kidney cells (BRK) co-transfected with E7 Af and RAS generated a smaller number of colonies, which may be partly associated with the inability of E7 Af to form a complex with the ubiquitin ligase UBR4, and further degrade the tumor suppressor protein PTPN14. On the other hand, immortalized PHK18Af showed greater resistance to differentiation in a medium enriched with serum and calcium. Finally, raft cultures derived from PHKs immortalized by both HPV-18 variants were morphologically similar and showed equivalent levels of proteins associated with cell differentiation and proliferation. Taken together, our data indicates that the HPV-18 As+AI variant has a greater oncogenic potential compared to the Af counterpart, in addition to interacting differently with some cellular targets. This study is unique in analyzing the biological and biochemical of E6/E7 oncoproteins of natural variants of HPV-18 in the context of the natural host, that is, epithelial cells
 
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Fecha de Publicación
2020-10-28
 
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