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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2021.tde-25102021-130239
Documento
Autor
Nombre completo
Igor de Luna Vieira
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2021
Director
Tribunal
Strauss, Bryan Eric (Presidente)
Gollob, Kenneth John
Andrade, Luciana Nogueira de Sousa
Simabuco, Fernando Moreira
Título en portugués
Avaliação dos efeitos autócrino e parácrino da terapia gênica com adenovírus portador de IFNbeta e sua relaçao com IFNAR1 no melanoma e microambiente murino
Palabras clave en portugués
Interferon beta
Melanoma
Microambiente tumoral
Morte celular
Receptor de interferon alfa e beta
Terapia genética
Resumen en portugués
O câncer é uma doença complexa, frequentemente sem cura e que está presente em todas as populações e em todas as idades. O câncer gera enormes perdas econômicas e emocionais, sendo que seus tratamentos atuais são caros e, tipicamente, pouco efetivos em casos avançados. O melanoma é um câncer de pele agressivo na sua evolução e frequentemente mortal para os hospedeiros, que apresentam a doença metastática, essa doença ainda possui poucos tratamentos efetivos. Frente a esta situação, é necessário a criação e desenvolvimento de novas abordagens com maior eficiência no tratamento do câncer. O Interferon beta (IFN) é uma citocina imuno-estimuladora com efeito anti- tumoral conhecido, porém sua aplicação sistêmica é tóxica. Nosso grupo propõe o uso de terapia gênica utilizando vetores adenovirais portadores do transgene terapêutico IFN (Ad-mIFN), assim, proporciona a produção do IFN de modo localizado e transiente, o que pode conferir um escape do efeito tóxico sistêmico. Os dados do grupo mostram que, em modelos murinos, a terapia gênica com Ad-mIFN in vitro resulta em morte celular e no modelo in situ induz retardo na progressão tumoral do melanoma. A investigação nesta tese teve como objetivo estudar os efeitos autócrinos e parácrinos nas células do microambiente e tumorais do melanoma após terapia gênica com IFN e a influência do seu receptor IFNAR1 neste contexto. Para investigar a influência da sinalização do IFN nos efeitos autócrinos e parácrinos, realizou-se o knockout do IFNAR1 em células da B16 e do microambiente (tEnd, NIH3T3) utilizando a tecnologia de CRISPR/Cas9. Os resultados mostraram que células transduzidas pelo Ad-mIFN necessitam da produção e liberação do IFN para a ativação da via do IFN/, pela ligação com os receptores IFNAR1/IFNAR2 e finalmente induzir a célula a morte, mecanismo conhecido como autócrino. As células transduzidas pelo Ad-mIFN também induzem efeito parácrino por inibir as células próximas, pelo mecanismo parecido com o autócrino, mas direcionado a outras células próximas. As células knockout para o IFNAR1 ficaram bloqueadas de receber os efeitos autócrinos e parácrinos do Ad-mIFN e da proteína recombinante do IFN (rIFN), porém mesmo sem o IFNAR1 elas continuam produzindo o efeito parácrino. Esses dados foram observados em células tumorais e células endoteliais e de fibroblastos. Outro estudo in vitro da terapia com Ad-mIFN e Ad-p19 na angiogênese utilizando células endoteliais, descobriu uma linhagem endotelial não responsiva ao tratamento com Ad-mIFN e a proteína IFN sozinha, porém essas células sofriam inibição quando colocadas em ensaios de efeito parácrino pela linhagem de melanoma transduzida com o Ad-mIFN. A observação desse fenômeno sugere a possibilidade da existência de outros fatores além do IFN, produzidos pelas células de melanoma transduzidas com Ad-mIFN, que estariam envolvidos no efeito parácrino. Ensaios de expressão gênica da linhagem de melanoma transduzida pelo Ad-mIFN mostraram aumento significativo de TRAIL, que pode ser um candidato para estar envolvido no efeito parácrino. Juntos, estes resultados indicam que a presença de IFNAR1 não é essencial para produção dos fatores necessários para induzir o efeito parácrino, porem a presença de IFNAR1 é necessário para a célula sofrer este efeito. Futuramente, as linhagens deficientes em IFNAR1 podem ser avaliadas em ensaios in vivo para revelar o papel do IFNAR1 nos efeitos autócrinos e parácrinos entre células tumor e seu microambiente após tratamento, incluindo com Ad- mIFN
Título en inglés
Evaluation of the autocrine and paracrine effects of IFN gene therapy with adenovirus and its relationship with IFNAR1 in melanoma and microenvironment of the murine model
Palabras clave en inglés
Cell death
Genetic therapy
Interferon-beta
Melanoma
Tumor microenvironment, Receptor interferon alpha-beta
Resumen en inglés
Cancer is a complex disease, often without cure, which is present in all populations and at all ages. Cancer generates enormous economic and emotional losses, and its current treatments are expensive and, typically, ineffective in advanced cases. Melanoma is an aggressive skin cancer in its evolution and often deadly for the hosts that present metastatic disease since few effective treatments are available. Faced with this situation, it is necessary to create and develop new approaches with greater efficacy in the treatment of cancer. Interferon beta (IFN) is an immunostimulatory cytokine with a known anti-tumor effect, but its systemic application is toxic. Our group proposes the use of gene therapy using adenoviral vectors that carry the therapeutic transgene IFN (Ad-mIFN), thus providing the production of IFN in a localized and transient way, which should avoid the systemic toxic effect. Our studies have shown that, in murine models, gene therapy with Ad-mIFN in vitro results in cell death and, in the in situ model, delays the progression of melanoma tumors. The research performed in this thesis aimed to study the autocrine and paracrine effects in the microenvironment and tumor cells of melanoma after IFN gene therapy and the role of the IFNAR1 receptor. To investigate the influence of IFN signaling on autocrine and paracrine effects, we performed IFNAR1 knockout on B16 and microenvironment cells (tEnd, NIH3T3) using the CRISPR / Cas9 technology. The results showed that cells transduced by Ad- mIFN require the production and release of IFN for activation of the IFN/ pathway, by binding with the IFNAR1/IFNAR2 receptors and finally inducing cell death, a mechanism known as autocrine. The cells transduced by Ad-mIFN also induce a paracrine effect by inhibiting nearby cells, by a mechanism similar to the autocrine but directed at other nearby cells. The cells with IFNAR1 knockout were blocked from receiving the autocrine and paracrine effects of Ad-mIFN and recombinant IFN protein (rIFN), however even without IFNAR1 they continue to produce the paracrine effect. These data were observed in tumor cells and endothelial and fibroblast cells. Another in vitro study of therapy with Ad-mIFN and Ad-p19 in angiogenesis identified an endothelial cell line unresponsive to treatment with Ad-mIFN and the IFN protein alone, however these cells suffered inhibition when tested for the paracrine effect provided by the melanoma cell line transduced with Ad-mIFN. The observation of this phenomenon suggests the existence of factors other than IFN, produced by melanoma cells transduced with Ad-mIFN, which would be involved in the paracrine effect. Gene expression assays of the melanoma lineage transduced by Ad-mIFN showed a significant increase in TRAIL, which may be a candidate for involvement in the paracrine effect. Together, these results indicate that the presence of IFNAR1 is not essential for the production of the factors necessary to induce the paracrine effect, however the presence of IFNAR1 is necessary for the cell to suffer this effect. In the future, IFNAR1-deficient strains can be evaluated in in vivo assays to reveal the role of IFNAR1 in the autocrine and paracrine effects between tumor cells and their microenvironment after treatment, including with Ad-mIFN
 
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Fecha de Publicación
2021-10-25
 
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