Os tumores de mama são frequentes em mulheres de todo o mundo, sendo responsáveis por um alto índice de óbito nessa população. Os tumores de mama se subdividem de acordo com a expressão dos receptores hormonais de estrógeno (ER) e progesterona (PR) e o receptor do fator de crescimento epidérmico humano do tipo 2 (HER2). Desta forma podem ser categorizados como luminais, HER2 e triplo-negativo (TNBC). Os tumores luminais apresentam melhor prognóstico, especialmente pelo benefício terapêutico, seguido dos HER2 que se beneficiam de terapias alvo. O subtipo TNBC é negativo para HER2 e os receptores hormonais e não possui tratamento direcionado, o que colabora para que esse perfil tumoral apresente pior prognóstico. Apesar do avanço no tratamento e prevenção do câncer, uma parcela significativa da população é acometida por esses tumores e constantemente sofrem recidivas, piorando drasticamente o desfecho clínico, independente do subtipo tumoral. A via Wnt é amplamente discutida na literatura, e suas alterações têm sido observadas em diversas malignidades humanas, incluindo os cânceres de mama. O FZD9 é um membro da família frizzled, os quais são caracterizados por serem receptores transmembranares que se ativam por meio de glicoproteínas Wnt. O objetivo do trabalho consistiu em identificar genes diferencialmente expressos em tumores de mama não triplo-negativo (nTNBC) e TNBC e validar os achados em populações com maior número amostral, incluindo validação em amostras de tumores de mulheres brasileiras. Além disso, objetivamos analisar os efeitos da repressão de FZD9 em linhagem celular. A identificação do FZD9 partiu de análise estatística de amostras de pacientes com câncer de mama submetidas à análise de expressão pela técnica de array (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array). Foram utilizados dados de RNA-seq dos estudos TCGA e SCAN-B para validação do perfil de expressão de FZD9 em função das características clinico-patológicas das pacientes. Foram utilizados ainda amostras de tumores de mama para detecção de FZD9 por meio da técnica de imuno-histoquímica (IHC). A repressão de FZD9 foi realizada pelo sistema lentivirus dCas9-KRAB-MeCP2 e o sgRNA(MS2)_zeo_backbone. A repressão foi confirmada por RT-qPCR, seguindo com ensaios de crescimento celular, migração e clonogênico. O FZD9 foi identificado como diferencialmente expresso entre tumores nTNBC e TNBC e associado com uma pior sobrevida global e livre de doença em ambos os perfis tumorais. Na análise por IHC foram observadas diferenças quanto ao subtipo tumoral (p=0,04) e status HER2 (0,009). Os pacientes classificados com marcação positiva para o FZD9 apresentaram pior sobrevida global, comparados aos casos negativos (HR=2,37; p=0,03). Foi observada ainda uma associação de FZD9 e Ki67 (p=0,037). O tratamento das linhagens celulares MDA-MB-453 e BT549 com TSA ou 5-aza resultou em diminuição dos níveis transcricionais de FZD9. A repressão de FZD9 por meio do sistema CRISPR modificado levou à diminuição do crescimento celular (p=0,001), de migração e da capacidade de formação de colônias (p=0,002). Ensaios adicionais precisam ser realizados a fim de comprovar o efeito da redução de FZD9 e seu papel na inibição da proliferação, migração e invasão em modelos celulares de câncer de mama. Contudo, sugere-se que a expressão diferencial de FZD9 possa ser um potencial alvo terapêutico e prognóstico para o benefício não apenas de pacientes portadoras de TNBC, mas também pacientes nTNBC

Breast tumors are frequent in women all over the world, being responsible for a high death rate in this population. Breast tumors are subdivided according to estrogen hormone receptors (ER) and progesterone (PR) and human epidermal growth factor receptor type 2 (HER2) expression. In this way they can be categorized as luminal, HER2 and triple-negative (TNBC). Luminal tumors have a better prognosis, especially due to the therapeutic benefit, followed by HER2 tumors that benefit from targeted therapies. The TNBC subtype is negative for HER2 and hormone receptors and does not have targeted treatment, which contributes to a worse prognosis. Despite advances in cancer treatment and prevention, a significant portion of the population is affected by these tumors and constantly relapses, dramatically worsening the clinical outcome, regardless of the tumor subtype. The Wnt pathway is widely discussed in the literature, and its alterations have been observed in several human malignancies, including breast cancers. FZD9 is a member of the frizzled family, which are characterized by being transmembrane receptors that are activated through Wnt glycoproteins. The aim of this study was to identify differentially expressed genes in non-triple-negative breast tumors (nTNBC) and TNBC and to validate the findings in populations with a larger sample size, including validation in tumor samples from Brazilian women. Furthermore, we aimed to analyze the effects of FZD9 repression in cell lines. The identification of FZD9 was based on statistical analysis of samples from patients with breast cancer submitted to expression analysis using the array technique (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array). RNA-seq data from the TCGA and SCAN-B studies were used to validate the FZD9 expression profile as a function of the clinicopathological characteristics of the patients. Samples of breast tumors and immunohistochemical analysis (IHC) were also used to detect FZD9. FZD9 repression was performed by the dCas9-KRAB-MeCP2 lentivirus system and the sgRNA(MS2)_zeo_backbone. Repression was confirmed by RT-qPCR, followed by cell growth, migration and clonogenic assays. FZD9 was identified as differentially expressed between nTNBC and TNBC tumors and associated with worse overall and disease-free survival in both tumor profiles. In the IHC analysis, differences were observed regarding tumor subtype (p=0.04) and HER2 status (0.009). Patients classified as positive for FZD9 had worse overall survival compared to negative cases (HR=2.37; p=0.03). An association of FZD9 and Ki67 was also observed (p=0.037). Treatment of MDA-MB-453 and BT549 cell lines with TSA or 5-aza resulted in decreased transcriptional levels of FZD9. The repression of FZD9 through the modified CRISPR system led to a decrease in cell growth (p=0.001), migration and colony formation capacity (p=0.002). Additional trials need to be performed in order to prove the effect of FZD9 reduction and its role in inhibiting proliferation, migration and invasion in breast cancer cell models. However, FZD9 has been shown to be a potential therapeutic and prognostic target to benefit not only TNBC patients but also nTNBC patients