INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: O câncer de pênis (CaPe) é uma doença rara com alta morbidade e mortalidade. A carcinogênese não é totalmente compreendida e, embora alguns biomarcadores relacionados a prognóstico tenham sido descritos, até o momento nenhum foi adotado na prática clínica. Nosso objetivo foi identificar, através de varredura por microarray, os miRNAs diferencialmente expressos (DEmiR) entre tecido tumoral (TT) versus não neoplásico (TNN) e pacientes com doença metastática versus localizada, bem como identificar os genes diferencialmente expressos (DEG) entre estes grupos e realizar análise integrativa miRNA-mRNA propondo assim elucidar a via de tumorigênese e a descoberta de novos biomarcadores para o CaPe. MÉTODOS: Foram coletadas prospectivamente amostras frescas de TT e TNN adjacente de 24 pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de pênis operados em nossa instituição entre julho de 2015 a janeiro de 2018. Inicialmente, foram selecionados 5 pacientes com doença localizada e 6 com doença metastática linfonodal para realização do microarray. O RNA foi purificado e a análise de varredura com o microarray utilizou o miRNA 4.0 Genechip (Affymetrix). Foram identificados os DEmiRs entre TT e TNN utilizando-se o programa TAC (Affymetrix) com fold change (FC)>2,0, p<0,01 e false discovery rate (FDR)<0,05. Foram também identificados os DEmiRs entre os grupos de doença metastática versus localizada com FC>1,5 e p<0,05. As expressões dos DEmiRs selecionados para validação independente (N=13) e em amostra expandida (N=24) nos grupos foram avaliadas através de qRT-PCR. Oitenta e três genes foram escolhidos para as comparações entre os grupos, baseados em suas relações com miRNAs encontrados no microarray pelo miRTarBase 8.0, descrição em CaPe e envolvidos em carcinogênese. A expressão dos genes escolhidos foi avaliada através da plataforma nanofluídica por qRT-PCR e comparadas entre os grupos de TT com TNN e com doença metastática e localizada. Foram correlacionados a expressão dos DEmiRs e os DEGs com os fatores clássicos de prognóstico no CaPe e a sobrevida câncer específica e global. Avaliação in silico foi realizada comparando-se os DEmiRs da comparação TT vs TNN com banco de dados ArrayExpress (E-MTAB-3087) previamente publicados em CaPe, bem como os DEGs no banco de dados Gene Expression Omnibus. RESULTADOS: A idade média dos 24 pacientes foi de 61,8 anos. O seguimento mediano foi de 39,8 meses. O tratamento local foi a penectomia parcial em 17 (70,8%) casos, o restante foi submetido à penectomia total. O estadiamento patológico foi pT1, pT2, pT3 em 4 (16,6%), 13 (54,2%) e 7 (29,2%) casos, respectivamente. Dezesseis (66,7%) pacientes foram submetidos a linfadenectomia inguinal. Destes, 11 (68,7%) tinham doença metastática pN+. Na análise de varredura por microarray entre TT versus TNN, encontramos 69 DEmiRs (41 sub e 28 superexpressos), dos quais 9 foram selecionados para validação baseado em maior FC, presença na lista dos tumores metastáticos versus localizados, publicação prévia em CaPe e CEC (miR-145-5p, miR432-5p, miR-487b-3p, miR-30a-5p, miR-149-5p, miR-200a-5p, miR-224-5p, miR-31-3p, miR-31-5p). Na validação independente somente o miR-149-5p não confirmou resultado do microarray. Cinco DEmiRs foram validados in silico no banco de dados E-MTAB3087 (miR-30a-5p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-145-5p e miR-31-5p). Na comparação entre tumor metastático versus localizado, 21 DEmiRs (5 sub e 16 superexpressos) foram identificados. Foram selecionados 7 deste grupo para validação de acordo com maior FC e relevância biológica (miR-181c-5p, 744-5p, 196b-5p, 200a-5p, 152-3p, 421, 149-5p). Na validação independente através de qRT-PCR nenhum manteve significância estatística, entretanto na amostra expandida com todos os 24 casos, houve confirmação dos miR-744-5p (p=0,003) e miR-421 (p=0,005). Nas correlações entre DEmiRs e o prognóstico, observamos que a menor expressão do miR-31-3p estava correlacionado ao grupo de maior estádio T (p=0,043) e que a maior expressão do miR421 reduzia a sobrevida global (p=0,038). Avaliamos a expressão de 83 genes por qRTPCR e encontramos 37 DEGs entre TT e TNN. Seis deles com boa acurácia para distinguir os grupos com AUC>0,78 (IL1A, MCM2, MMP1, MMP12, SFN e VEGFA). Na análise integrativa, encontramos 8 pares de miRNA-mRNA que mudaram significativamente sua relação, sendo a maior alteração observada para o par miR-432- 5p-TP53. Entre os DEGs da comparação entre os pacientes metastáticos e localizados encontramos 7 DEGs (CCND1, EGFR, ENTPD5, HOXA10, IGF1R, MYC, SNAI2), todos com boa acurácia (AUC>0,74) na distinção entre os grupos. Observamos correlações significativas entre maior expressão do MMP1 com tamanho tumoral (p=0,042), grau (p=0,045), estádio T patológico (p=0,018) e invasão perineural (p=0,007). O gene MMP1 é regulado pelo miR-145-5p que está subexpresso na amostra tumoral. Observamos também correlação entre maior expressão do CCND1 (p=0,006) e EGFR (p=0,001) com grau tumoral; e menor expressão de MMP9 com invasão microvascular (p=0,044). Nas curvas de sobrevida, a maior expressão dos genes CCND1, EGFR, GADD45A, MYC, SNAI2 e SRC e menor dos CDH1, CDKN1A, KLF4 e TP63 estavam associados a mortalidade por CaPe. A maior expressão dos genes FGF2, GADD45A, IL6, MYC, NES e NRP1 e a subexpressão do CDH1 foram correlacionadas a menor sobrevida global. CONCLUSÕES: Descrevemos uma assinatura molecular relacionada à carcinogênese do pênis baseada nas expressões dos miR-432-5p, miR-478b-3p, miR-145-5p, miR-30a-5p, miR-200a-5p, miR-224-5p, miR-31-3p e miR-31-5p e dos genes IL1A, MCM2, MMP1, MMP12, SFN e VEGFA. Identificamos um painel de potenciais biomarcadores de prognóstico no CaPe baseada na expressão dos miR-421, miR-744-5p, miR31-3p e dos genes CCND1, CDH1, CDKN1A, EGFR, ENTPD5, FGF2, GADD45A, HOXA10, IGF1R, KLF4, MMP1, MYC, NES, NRP1, SNAI2, SRC e TP63

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Penile cancer (PeCa) is a rare disease with high morbidity and mortality. Its carcinogenesis is not fully understood and, although some prognostic-related biomarkers have been described, none have been adopted in clinical practice to date. Our objective was to identify, through microarray scanning, the differentially expressed miRNAs (DEmiR) between tumor tissue (TT) versus nonneoplastic tissue (NNT) and patients with metastatic versus localized disease, as well as to identify the differentially expressed genes (DEG) between these groups and perform integrative miRNA-mRNA analysis thus proposing to elucidate the tumorigenesis pathway and the discovery of new biomarkers for PeCa. METHODS: Fresh samples of TT and adjacent NNT were prospectively collected from 24 patients with squamous cell carcinoma (SCC) of the penis operated on at our institution between July 2015 and January 2018. Initially, 5 patients with localized disease and 6 with metastatic disease were selected for microarray performance. The RNA was purified and microarray scanning analysis used the miRNA 4.0 Genechip (Affymetrix). The DEmiRs between TT and NNT were identified using the TAC program (Affymetrix) with fold change (FC)>2.0, p<0.01 and false discovery rate (FDR)< 0.05. DEmiRs were also identified between the groups of metastatic versus localized disease with FC>1.5 and p<0.05. The expressions of DEmiRs selected for independent validation (N=13) and in an expanded sample (N=24) groups were evaluated using qRT-PCR. Eighty-three genes were chosen for comparisons between groups, based on their relationships with miRNAs found in the microarray by miRTarBase 8.0, described in PeCa and involved in carcinogenesis. The expression of the chosen genes was evaluated using the nanofluidic platform by qRTPCR and compared between groups of TT with NNT and with metastatic and localized disease. The expression of DEmiRs and DEGs were correlated with classical prognostic factors in PeCa and cancer-specific and overall survival. In silico evaluation was performed by comparing the DEmiRs of the TT vs NNT comparison with the ArrayExpress database (E-MTAB-3087) previously published in CaPe, as well as the DEGs in the Gene Expression Omnibus database. RESULTS: The average age of the 24 patients was 61.8 years. The median follow-up was 39.8 months. Local treatment was partial penectomy in 17 (70.8%) cases, the remainder underwent total penectomy. The pathological staging was pT1, pT2, pT3 in 4 (16.6%), 13 (54.2%) and 7 (29.2%) cases, respectively. Sixteen (66.7%) patients underwent inguinal lymphadenectomy. Of these, 11 (68.7%) had pN+ metastatic disease. In microarray scanning analysis between TT versus NNT, we found 69 DEmiRs (41 under and 28 overexpressed), of which 9 were selected for validation based on higher FC, presence in the list of metastatic versus localized tumors, previous publication in PeCa and SCC (miR-145-5p, miR-432-5p, miR487b-3p, miR-30a-5p, miR-149-5p, miR-200a-5p, miR-224-5p, miR-31-3p, miR- 31- 5p). In the independent validation, only miR-149-5p did not confirm the microarray result. Five DEmiRs were validated in silico in the E-MTAB-3087 database (miR-30a5p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-145-5p and miR-31-5p). In the comparison between metastatic versus localized tumor, 21 DEmiRs (5 under and 16 overexpressed) were identified. Seven from this group were selected for validation according to higher FC and biological relevance (miR-181c-5p, 744-5p, 196b-5p, 200a-5p, 152-3p, 421, 149-5p). In the independent validation through qRT-PCR, none of them maintained statistical significance, however in the expanded sample with all 24 cases, there was confirmation of miR-744-5p (p=0.003) and miR-421 (p=0.005). In the correlations between DEmiRs and prognosis, we observed that the lower expression of miR-31-3p was correlated with the higher stage T group (p=0.043) and that the higher expression of miR-421 with reduced overall survival (p=0.038). We evaluated the expression of 83 genes by qRTPCR and found 37 DEGs between TT and NNT. Six of them presented good accuracy to distinguish groups with AUC>0.78 (IL1A, MCM2, MMP1, MMP12, SFN and VEGFA). In the integrative analysis, we found 8 pairs of miRNA-mRNA that significantly changed their relationship, with the greatest change being observed for the pair miR-432-5p-TP53. Among the DEGs in the comparison between metastatic and localized patients, we found 7 DEGs (CCND1, EGFR, ENTPD5, HOXA10, IGF1R, MYC, SNAI2), all with good accuracy (AUC>0.74) in the distinction between groups. We observed significant correlations between increased MMP1 expression and tumor size (p=0.042), grade (p=0.045), pathological T stage (p=0.018) and perineural invasion (p=0.007). The MMP1 gene is regulated by miR-145-5p which is under expressed in the tumor sample. We also observed a correlation between higher expression of CCND1 (p=0.006) and EGFR (p=0.001) with tumor grade; and lower MMP9 expression with microvascular invasion (p=0.044). In the survival curves, higher expression of genes CCND1, EGFR, GADD45A, MYC, SNAI2 and SRC and lower expression of CDH1, CDKN1A, KLF4 and TP63 were associated with mortality from PeCa. Higher expression of FGF2, GADD45A, IL6, MYC, NES and NRP1 genes and under expression of CDH1 were correlated with lower overall survival. CONCLUSIONS: We described a molecular signature related to penile carcinogenesis based on the expressions of miR-432-5p, miR-478b-3p, miR-145-5p, miR-30a-5p, miR-200a-5p, miR-224-5p, miR-31-3p and miR-31-5p and IL1A, MCM2, MMP1, MMP12, SFN and VEGFA genes. We identified a panel of potential prognostic biomarkers in PeCa based on the expression of miR-421, miR-744-5p, miR31-3p and the genes CCND1, CDH1, CDKN1A, EGFR, ENTPD5, FGF2, GADD45A, HOXA10, IGF1R, KLF4, MMP1, MYC, NES, NRP1, SNAI2, SRC and TP63