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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2022.tde-22092022-123854
Documento
Autor
Nome completo
Juliana Alves de Camargo
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2022
Orientador
Banca examinadora
Faria, Sabrina Thalita dos Reis (Presidente)
Trarbach, Ericka Barbosa
Leite, Katia Ramos Moreira
Schenka, André Almeida
Título em português
Edição genômica com CRISPR/Cas9 para avaliação do papel da MMP9 e seu regulador o microRNA-21 no câncer de próstata metastático: Estudo in vitro e in vivo
Palavras-chave em português
Apoptose
Expressão gênica
Metaloproteinase 9 da matriz
MicroRNAs
Neoplasias da próstata
Sistemas CRISPR-Cas
Resumo em português
INTRODUÇÂO:O Câncer de Próstata (CaP), possui alta prevalência e representa um importante problema de saúde, com forte impacto econômico se considerarmos o rastreamento, diagnóstico, tratamento e a mortalidade pela doença. Com o avanço da metodologia do CRISPR, novas possibilidades se abriram para o entendimento e controle dos mecanismos de resistência celular. A edição gênica pela técnica de CRISPR-Cas9 é efetiva na correção de mutações celulares que promovem resistência. O microRNA-21, que atua sobre o gene supressor tumoral RECK e o oncogene MMP-9, apresenta um papel importante no processo de migração e invasão das células tumorais para outros tecidos, gerando metástases. Devido à importância destas moléculas na carcinogênese, são necessárias maiores investigações sobre o seu papel no CaP. OBJETIVO:Avaliar o papel da MMP-9 e seu regulador indireto miR-21 no CaP, com a edição gênica pela técnica de CRISPR-Cas9. MÉTODOS: Inicialmente foi feita a inserção das sequências de RNAs guia (sgRNA) da MMP9 e miR-21 no plasmídeo PX-330. Em seguida, os plasmídeos com os insertos para MMP-9 foram transfectados em linhagens celulares de CaP DU145 e PC-3M-luc-C6. Foi feita a análise da expressão gênica e proteica da MMP9 por qPCR e Western Blotting, e a imunofluorescência. Os genes alvo do miR-21, incluindo RECK, MARKS, BTG2, PDCD4, as integrinas ITGB1 e ITGB3, CDH1, BAX e mTOR, foram avaliados por qPCR. Foi feita a citometria de fluxo para validar a expressão proteica relacionada à apoptose e proliferação celular, em células editadas para MMP9 e miR-21, utilizando os marcadores Annexin5 e 7-AAD, eKi67 respectivamente. Foi feito o ensaio de invasão com matrigel, e as células foram analisadas 48 horas após, com microscopia ótica. O grupo controle consistiu em células transfectadas com plasmídeo PX-330 sem as inserções de sgRNA(Scramble). O crescimento tumoral foi avaliado por um sistema de bioluminescência in vivo, após a injeção de 300 mil células, divididas em grupos, Scramble, editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 em camundongos Balb/c Nude. Esses animais foram acompanhados por 14 dias.RESULTADOS: Foi realizada a padronização das técnicas de digestão e inserção dos sgRNAs da MMP9 e miR-21 no plasmídeo PX-330, validadas por sequenciamento. Após essa etapa, observamos que as linhagens celulares transfectadas com o plasmídeo com sgRNA1 e 2 para MMP9 apresentaram GFP positivo, o que mostra a eficácia da transfecção. As células editadas para miR-21 com CRISPR-Cas9 apresentaram expressão gênica de RECK, MARKS, BTG2, e PDCD4 aumentadas em relação ao grupo Scramble. CDH1 e integrinas ITGB3 e ITGB1 foram aumentadas em células editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 quando comparado ao Scramble.O aumento do BAX e a diminuição da expressão de mTOR foram observados nas células editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 comparação ao grupo Scramble. Estes resultados foram validados por citometria de fluxo, mostrando a redução da proliferação e aumento da apoptose em células editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 quando comparados ao Scramble. No ensaio de invasão celular, observamos que as células editadas para MMP9 e miR-21 apresentam taxas de invasão inferiores às do grupo Scramble. Nos experimentos in vivo, o crescimento tumoral foi significativamente reduzido nos animais que receberam células editadas com CRISPR-Cas9 para MMP9, quando comparadas ao Scramble. Não encontramos diferença nos animais que receberam células editadas para miR-21. CONCLUSÃO: A edição gênica por CRISPR-Cas9 de MMP9 e miR-21 em linhagens celulares de CaP metastáticas modula fatores moleculares que atenuam a proliferação e invasão celular e estimulam a apoptose, possivelmente impedindo a evolução do tumor
Título em inglês
CRISPR/Cas9 genomic editing to evaluate the role of MMP9 and microRNA-21 in metastatic prostate cancer: In vitro and in vivo study
Palavras-chave em inglês
Apoptosis
CRISPR-Cas systems
Gene expression
Matrix metalloproteinase 9
MicroRNAs
Prostatic neoplasms
Resumo em inglês
INTRODUCTION: Prostate Cancer (PCa) has a high prevalence and represents an important health problem, with a strong economic impact if we consider screening, diagnosis, treatment, and mortality from the disease. With the advance of CRISPR methodology, new possibilities have opened for the understanding and control of cellular resistance mechanisms. Gene editing by the CRISPR-Cas9 technique is effective in correcting cellular mutations that promote resistance. The microRNA-21, which acts on the tumor suppressor gene RECK and the oncogene MMP-9, has an important role in the process of migration and invasion of tumor cells into other tissues, generating metastases. Due to the importance of these molecules in carcinogenesis, further investigations of their role in PCa are needed. OBJECTIVE: To evaluate the role of MMP-9 and the indirect regulator miR-21 in PCa, with gene editing by CRISPR-Cas9 technique. METHODS: Initially, insertion of the MMP9 and miR-21 guide RNAs (sgRNA) sequences into the PX-330 plasmid was performed. Then, the plasmids with the inserts for MMP-9 were transfected into PCa DU145 and PC-3M-luc-C6 cell lines. MMP9 gene and protein expression analysis was performed by qPCR, Western Blotting, and immunofluorescence. The target genes of miR-21, including RECK, MARKS, BTG2, PDCD4, the integrins ITGB1 and ITGB3, CDH1, BAX and mTOR, were evaluated by qPCR. Flow cytometry was performed to validate protein expression related to apoptosis and cell proliferation, in cells edited for MMP9 and miR-21, using the markers Annexin5, 7-AAD andKi67 respectively. Matrigel invasion assays were performed, and cells were analyzed after 48 hours, with light microscopy. The control group consisted of cells transfected with plasmid PX-330 without the sgRNA insertions(Scramble). Tumor growth was assessed by an in vivo bioluminescence system in mice Balb/c Nude. After injection of 300.000 cells, divided into groups, Scramble, edited for MMP9 and miR-21 with CRISPR-Cas9 These animals were followed up for 14 days. RESULTS: We standardized the techniques of digestion and insertion of the sgRNAs of MMP9 and miR-21 into the plasmid PX-330, validated by sequencing. After this step, we observed that the cell lines transfected with the plasmid with sgRNA1 and 2 for MMP9 showed positive GFP, which shows the efficiency of the transfection. Cells edited for miR-21 with CRISPR-Cas9 showed increased gene expression of RECK, MARKS, BTG2, and PDCD4 compared to the Scramble group. CDH1 and integrins ITGB3 and ITGB1 were increased in cells edited for MMP9 and miR-21 with CRISPR-Cas9 when compared to Scramble. Increased BAX and decreased mTOR gene expression were observed in cells edited for MMP9 and miR-21 with CRISPR-Cas9 compared to the Scramble group. These results were validated by flow cytometry, showing reduced proliferation and increased apoptosis in cells edited for MMP9 and miR-21 with CRISPR-Cas9 compared to Scramble. In the cell invasion assay, we observed that cells edited for MMP9 and miR-21 have lower invasion rates than the Scramble group. In the in vivo experiments, tumor growth was significantly reduced in animals that received cells edited with CRISPR-Cas9 for MMP9 compared to Scramble. We found no difference in animals that received cells edited for miR-21. CONCLUSION: Gene editing by CRISPR-Cas9 for MMP9 and miR-21 in metastatic PCa cell lines modulates molecular factors that attenuate cell proliferation and invasion and stimulate cell apoptosis, possibly preventing PCa tumor evolution
 
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Data de Publicação
2022-09-23
 
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