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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2020.tde-08062021-130510
Document
Auteur
Nom complet
Caroline Ranéa
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2020
Directeur
Jury
Hallak, Jorge (Président)
Leite, Katia Ramos Moreira
Lopes, Paula Intasqui
Nichi, Marcilio
Titre en portugais
Determinação de meio de cultura favorável e período de incubação espermática de amostras seminais astenozoospérmicas
Mots-clés en portugais
Espermatozoides
Incubação
Meios de cultura
Motilidade
Técnicas de reprodução assistida
Viabilidade
Resumé en portugais
O objetivo deste estudo foi padronizar o período ideal de incubação espermática "in vitro", e determinar o meio de cultura favorável para o espermatozoide. Foram incluídas 82 amostras seminais astenozoospérmicas, as quais foram divididas em dois protocolos distintos [protocolo I (n=28) e protocolo II (n=54)]. No protocolo I, as amostras a fresco (sem utilização de meio de cultura - T0) foram incubadas a 36,6ºC em atmosfera de 5% de CO2 durante 4 períodos: T1 (1 hora), T2 (2 horas), T3 (3 horas) e T4 (4 horas). No protocolo II, as amostras foram processadas pelo método gradiente descontínuo de densidade ou lavagem simples e em seguida, foram incubadas por 2 horas (período definido pelo protocolo I) em diferentes meios de cultura comercialmente disponíveis: a) Fluído Tubário Humano (do inglês Human Tubal Fluid - HTF®) + 15% Soro Substituto Sintético (do inglês Serum Substitute Supplement - SSS®), b) Meio de Cultura para Uso Contínuo (do inglês Continuous Single Culture Medium - CSCM®) + 10% Albumina Sérica Humana (do inglês Human Serum Albumin - HSA®), c) meio de Lavagem para o Espermatozoide (do inglês Sperm Rinse - SR®) + frutose e carnitina, d) Meio de Gametas para Fertilização In Vitro (do inglês Gametes in Vitro Fertilization - G-IVF®) + frutose + 15% SSS®. Parâmetros seminais e testes funcionais [análise espermática assistida por computador (SCA®), dosagem de radicais livres de oxigênio (ROS), avaliação da integridade do DNA (SCSA®), atividade mitocondrial dos espermatozoides (DAB)] foram analisados caracterizando os grupos pré e pós-incubação. Para análise estatística utilizamos Análise de variância (ANOVA), coeficiente de Correlação de Pearson, teste T de Student e adotamos P<0.05. No protocolo I, observamos aumento significativo na motilidade progressiva dos espermatozoides (T2; P<0,003) incubados durante 2 horas quando comparados com T1, T3 e T4. Além disso, no protocolo II podemos inferir que os meios de cultura CSCM® e G-IVF® são adequados para cultura de células espermáticas humanas, visto que trouxeram benefícios para motilidade dos espermatozoides (Motilidade Progressiva (MP) P < 0,001 e Motilidade Total (MT) P=0,025 vs. MP P=0,023) respectivamente. Para os demais meios de cultura, não observamos diferença significativa. Em conclusão, amostras seminais astenozoospérmicas encaminhadas para técnicas de Reprodução Humana Assistida, podem serem incubadas por 2 horas com meio de cultura CSCM® + HSA®, a fim de melhorar a porcentagem de motilidade dos espermatozoides
Titre en anglais
Determination of favorable culture medium and sperm incubation period of asthenozoospermic seminal samples
Mots-clés en anglais
Culture media
Incubation
Mortality
Reproductive techniques assisted
Spermatozoa
Viability
Resumé en anglais
The aim of this study was to standardize the ideal sperm incubation period "in vitro", and to determine the favorable culture medium for sperm. 82 asthenozoosperm seminal samples were included, which were divided into two distinct protocols [protocol I (n= 28) and protocol II (n= 54)]. In protocol I, fresh samples (without culture medium - T0) were incubated at 36.6ºC in a 5% CO2 atmosphere for 4 periods: T1 (1 hour), T2 (2 hours), T3 (3 hours) and T4 (4 hours). In protocol II, the samples were processed using the batch density gradient method or simple washing and then were incubated for 2 hours (period defined by protocol I) in different commercially available culture media: a) Human Tubal Fluid - HTF® + 15% Synthetic Serum Substitute - SSS®, b) Single Continuous Culture Medium - CSCM® + 10% Human Serum Albumin - HSA®, c) Sperm Rinse medium - SR® + fructose and carnitine, d) In Vitro Fertilization Medium - G- IVF® + fructose + 15% SSS®. Seminal parameters and functional tests [Sperm Computer Analysis (SCA®), Sperm Chromatin Structural Assay (SCSA®); Reactive Oxygen Species level (ROS), sperm mitochondrial activity (DAB)] were analyzed characterizing groups pre and post-incubation. For statistical analysis we used analysis of variance (ANOVA), Pearson's correlation coefficient, Student's t test and we adopted P < 0.05. In protocol I, we observed a significant increase in the progressive motility of sperm (T2; P <0.003) incubated for 2 hours when compared with T1, T3 and T4. Furthermore, in protocol II we can infer that the CSCM® and G-IVF® culture media are suitable for culturing human sperm cells, since they brought benefits to sperm motility (Progressive Motility (MP) P < 0.001 and Total Motility (MT) P = 0.025 vs. MP P = 0.023) respectively. For the other culture media, we did not see any significant difference. In conclusion, asthenozoospermic seminal samples sent for Assisted Human Reproduction techniques, can be incubated for 2 hours with CSCM® + HSA® culture medium, in order to improve the motility percentage of the sperm.
 
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Date de Publication
2021-06-14
 
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