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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.5.2017.tde-16112017-090518
Document
Author
Full name
Darlan da Silva Candido
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2017
Supervisor
Committee
Ferreira, Ludmila Rodrigues Pinto (President)
Ianni, Barbara Maria
Peron, Jean Pierre Schatzmann
Winter, Lucile Maria Floeter
Title in Portuguese
Análise da biogênese de microRNAs na cardiomiopatia chagásica crônica
Keywords in Portuguese
Aldeído desidrogenase
Biogênese de microRNAs
Cardiomiopatia chagásica
Dicer1 proteína humana
Doença de Chagas
Estresse oxidativo
Fibrose
MicroRNAs
Abstract in Portuguese
A cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) é a principal complicação decorrente da infecção pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Trata-se de uma cardiomiopatia dilatada, caracterizada por um intenso infiltrado inflamatório, fibrose, dilatação das câmaras cardíacas, hipertrofia de cardiomiócitos e anormalidades de condução. Sua fisiopatologia é complexa e ainda não se consegue explicar porque apenas 30% dos pacientes infectados desenvolvem essa complicação. Nesse contexto, nosso laboratório descreveu pela primeira vez uma redução na expressão de microRNAs (miRNAs) enriquecidos em músculo (myomiRs) no miocárdio de pacientes com CCC. Sabendo-se que disfunções na biogênese de miRNAs em modelos animais levam ao desenvolvimento de cardiomiopatia do tipo dilatada com redução da expressão de myomiRs, hipotetizou-se que a CCC em humanos estaria associada a um prejuízo na biogênese de miRNAs no miocárdio. Dessa forma, amostras de ventrículo esquerdo de miocárdio de pacientes com CCC (n=16) e controles não-cardiomiopatas (n=6) foram utilizadas para avaliar: 1) a expressão gênica e proteica da maquinaria da biogênese de miRNAs (Drosha, Exportina-5, RAN, Dicer1, TRBP, PACT e Argonauta2), por qPCR e western blotting, respectivamente; 2) a expressão do transcrito primário (pri-miRNA), precursor (pré-miRNA) e miRNA maduro de myomiRs (miR-1, -133a, -133b, -208a, -208b, e -499); 3) o perfil de miRNAs diferencialmente expressos em CCC utilizando qPCR array; e 4) a interação dos miRNAs diferencialmente expressos com disfunções características da CCC (fibrose, miocardite, arritmia e hipertrofia) por meio de análises de bioinformática. Nossos resultados apontam para uma não-alteração nas etapas nucleares da biogênese de miRNAs (transcrição, edição e transporte), já que não foram encontradas alterações na expressão de pri- e pré-miRNAs de myomiRs, bem como dos componentes protéicos da biogênese, Drosha, Exportina-5 e RAN. Entretanto, observou-se uma disfunção na segunda etapa de edição da biogênese, citoplasmática, caracterizada por uma redução de 2/3 nos níveis protéicos de Dicer1, a qual não foi acompanhada por uma redução na expressão de seu RNA mensageiro. Evidenciou-se ainda, uma redução na expressão de 97,5% dos miRNAs maduros diferencialmente expressos no miocárdio de pacientes com CCC, incluindo myomiRs. As análises in silico revelaram haver participação dos miRNAs diferencialmente expressos em disfunções associadas a CCC, com destaque para a fibrose miocárdica, nodo central da rede. Experimentos adicionais preliminares sugeriram o acúmulo de adutos de 4-hidroxi-2-nonenal, decorrente do estresse oxidativo e de uma menor atividade da enzima aldeído desidrogenase 2, como uma possível causa para as alterações encontradas. Este é o primeiro estudo a caracterizar a biogênese de microRNAs em uma cardiomiopatia. Além disso, demonstrou-se que uma redução global do perfil dos miRNAs maduros diferencialmente expressos, decorrente uma disfunção na enzima Dicer1, está associada a eventos patológicos característicos da CCC. Estes mecanismos apresentam relevância biológica e terapêutica, podendo ser possivelmente compartilhados com cardiomiopatias de outras etiologias
Title in English
Analysis of microRNA biogenesis in chronic chagas disease cardiomyopathy
Keywords in English
Aldehyde dehydrogenase
Chagas cardiomyopathy
Chagas disease
Dicer1 protein human
Fibrosis
MicroRNA biogenesis
MicroRNAs
Oxidative stress
Abstract in English
Chronic Chagas disease cardiomyopathy (CCC) is the most severe complication of the infection by the haemoflagellate protozoan Trypanosoma cruzi. This dilated cardiomyopathy is characterized by an intense inflammatory infiltrate, fibrosis, dilation of cardiac chambers, cardiomyocyte hypertrophy and conduction abnormalities. Its pathophysiology is complex and why only 30% of patients experience this complication remains an open question. In this regard, our laboratory described for the first time a reduction in the expression of muscle-enriched microRNAs (myomiRs) in human CCC myocardium. Knowing that biogenesis dysfunction and myomiR reduced expression have been associated to the development of dilated cardiomyopathy in animal models, we hypothesized that an impairment of myocardial microRNA biogenesis would be associated to CCC. Hence, left ventricle tissue samples from CCC patients (16) and non-cardiomyopathy donors (6) were used to analyze: 1) mRNA and protein expression, by qPCR and western blotting, of canonical microRNA biogenesis machinery (Drosha, Exportin-5, RAN, Dicer1, TRBP, PACT, AGO2); 2) primary transcript (pri-miR), precursor (pre-miR) and mature microRNA expression of myomiRs (miR-1, -133a, -133b, -208a, -208b, e -499); 3) mature microRNA profile using qPCR array; and 4) the interaction between differentially expressed mature microRNAs and hallmark CCC dysfunctions (fibrosis, myocarditis, hypertrophy and arrhythmia) using bioinformatics tools. Our results point to a non-dysfunction of biogenesis nuclear steps (transcription, editing and transport), since expression of pri-, pre-microRNAs, Drosha, Exportin-5 and Ran are similar between CCC patients and controls. However, we observed an alteration in the cytoplasmic editing step, characterized by a 2/3 reduction in Dicer1 protein levels. In addition, a major downregulation of differentially expressed mature microRNAs (97,5%) was noticed. In silico analysis revealed an association between differentially expressed microRNAs and CCC hallmarks, particularly fibrosis, a central node in the network. Additional preliminary data suggest 4-hydroxi-2-nonenal myocardial accumulation, resulting from oxidative stress and aldehyde dehydrogenase 2 lower activity, as a possible cause for the alterations here described. This is the first study to conduct a comprehensive analysis of microRNA biogenesis machinery in a cardiomyopathy. Moreover, we have shown a major reduction in the expression of mature microRNAs, due to lower Dicer1 protein levels, to be associated to CCC hallmark dysfunctions. These mechanisms are biologically and therapeutically relevant, and may be shared with cardiomyopathies from different etiologies
 
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Publishing Date
2017-11-16
 
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