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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2020.tde-07012020-132454
Documento
Autor
Nome completo
Mariana Prado Marmorato
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Kallas, Esper Georges (Presidente)
Moro, Ana Maria
Ribeiro, Ana Freitas
Santos, Keity Souza
Título em português
Caracterização da expansão de plasmoblastos e dos anticorpos deles derivados após a vacinação com 17DD e infecção natural pelo vírus da febre amarela selvagem
Palavras-chave em português
Anticorpos monoclonais
Febre amarela
Imunidade humoral
Linfócitos B
Região variável de imunoglobulina
Vacina contra a febre amarela
Resumo em português
A febre amarela (FA) é uma arbovirose que ainda representa um problema de saúde pública no Brasil, onde se notificou um surto recente com 1376 casos confirmados e taxa de letalidade de 35%. A vacina antiamarílica é altamente eficaz, conferindo imunidade protetora contra o vírus da febre amarela (YFV), provavelmente pela indução de anticorpos (Abs) neutralizantes. Apesar da eficácia da vacina estar bem estabelecida, a cobertura vacinal ainda é deficiente e não existe um tratamento específico para FA. Desta forma, o uso de Abs neutralizantes na prevenção e no tratamento pode representar uma estratégia promissora de enfrentamento da doença. O objetivo deste projeto foi caracterizar a cinética de expansão da população de plasmoblastos (PBs) circulantes e o repertório de Abs monoclonais deles derivados presentes no sangue periférico de pacientes com febre amarela (n=70) ou que receberam a vacina 17DD (n=7), bem como a capacidade de ligação e neutralização do YFV. A análise de citometria de fluxo multiparamétrica revelou que a frequência de PBs (CD27high CD38high) não aumentou de forma significativa após a vacinação, ao contrário do que ocorreu no grupo de pacientes infectados pelo YFV, em que foi observada uma grande expansão de PBs (p < 0,001), atingindo o pico de expansão no 6º dia após o início dos sintomas. Os PBs circulantes derivados dos dois grupos de doadores foram isolados e submetidos às reações de amplificação e sequenciamento das regiões variáveis das cadeias leve e pesada das Imunoglobulinas (Ig). Foram amplificados 668 pares de Ig de ambos os grupos com uma alta taxa de identidade com sequências germinativas e alto nível de hipermutação somática. Os genes da família IgHV3 foram frequentemente detectados nas Ig isoladas nos dois grupos estudados, seguidos por IgHV4 em infectados e IgHV1 em vacinados. Os Abs derivados do grupo de infectados foram clonados em plasmídeos e expressos para avaliação de suas afinidades e capacidades de neutralização da cepa YFV-17D. A afinidade de ligação dos Abs foi modesta e nenhum deles foi capaz de neutralizar a cepa 17D in vitro. Nossos dados sugerem que a infecção por YFV induz uma expansão acentuada de PBs que expressam Abs de baixa afinidade e capacidade neutralizante durante a fase aguda da doença
Título em inglês
Characterization of plasmablasts expansion and antibodies derived therefrom after 17DD vaccination and natural infection with wild-type yellow fever virus
Palavras-chave em inglês
Antibodies monoclonal
B lymphocytes
Immunity humoral
Immunoglobulin variable region
Yellow fever
Yellow fever vaccine
Resumo em inglês
Yellow fever (YF) is an arboviral disease that remains a public health problem in Brazil, where a recent outbreak occurred with 1376 confirmed cases 35% of lethality rate. The yellow fever vaccine is highly effective conferring protective immunity against yellow fever virus (YFV) probably by induction of neutralizing antibodies (Abs). Despite the effectiveness of the well-established vaccine, vaccination coverage is poor and there is no specific treatment for YF yet, which has a high mortality rate. Faced with the constant challenges in the fight against YFV and considering the relevance of neutralizing Abs in prevention, the therapeutic use of these molecules may represent a promising strategy. Thus, the aim of this project is to characterize kinetics expansion of circulating plasmablasts (PBs) and the PBs-derived repertoire of monoclonal Abs present in the peripheral blood of patients with yellow fever (n=70) or vaccinated with 17DD (n=7), as well as the YFV binding and neutralization capability . The multiparametric flow cytometric analysis revealed the frequency of PBs (CD27high CD38high) did not show a significant increase in the vaccinated group; in contrast in YFV infected patients the magnitude of PBs response was significantly high (P < 0.001), reaching peaking number on the 6th day after the onset of symptoms. Circulating PBs derived from the two groups were isolated and subjected to amplification and sequencing reactions of the variable regions of heavy and light chains from the immunoglobulin (Ig). A total of 668 Ig pairs from both groups were obtained and they presented a high identity rate with germline sequences and elevated level of somatic hypermutation. The IgHV3 family was frequently seen among the isolated Ig from both groups followed by IgHV4 in infected individuals and IgHV1 in vaccinees. Abs were isolated from the infected group after cloning and transfection, though the binding affinity was modest and none of them were able to neutralize the 17D strain in vitro. Our data suggest that YFV infection stimulates a significant PBs expansion of low affinity and poor neutralizing capability Abs during the acute phase of the disease
 
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Data de Publicação
2020-01-07
 
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