A Imunoterapia Alérgeno Específica (IAE) é um tratamento seguro e eficaz com efeitos duradouros. Ácaros de Poeira Domiciliar estão entre as principais fontes de alérgenos no mundo e são uma das IAE mais aplicadas. Dentre os ácaros, Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) e Blomia tropicalis (Blo t) são as principais espécies clinicamente relevantes nos países tropicais. Der p 1, 2, 5, 7, 23 e 21 parecem representar os alérgenos mais importantes. Enquanto Der p 10 (tropomiosina), seja considerado um alérgeno maior em outras fontes, como camarão e barata, é considerado um alérgeno menor em ácaros, para populações que não estão normalmente expostas a baratas, diferentemente do que acontece no Brasil. Blomia tropicalis é uma espécie menos estudada, sendo Blo t 5 seu alérgeno principal. A dinâmica de reconhecimento de epítopos ao longo da IAE ainda não foi bem estudada, além disso, regiões antigênicas capazes de induzir IgG, mas não anticorpos IgE são especialmente interessantes como alvos promissores para formulação de vacinas. Por outro lado, a despeito dos grandes avançados feitos na área de alergologia molecular para o diagnóstico das alergias, há um grande descompasso em relação ao tratamento, já que falta padronização dos extratos em relação à qualidade e à quantificação de alérgenos, cuja composição permanece pouco estudada. Portanto, nosso objetivo foi caracterizar o extrato de ácaros utilizado nessa imunoterapia e avaliar a dinâmica de reconhecimento de epítopos de IgE e IgG4 durante imunoterapia sublingual (ITSL) bem como identificar epítopos capazes de induzir IgG4, mas não IgE em indivíduos alérgicos. Para isso, as sequências dos alérgenos mais relevantes, além do Der p 10 foram incluídas em um microarray de peptídeos 15-aa e testadas contra um pool de soros de 10 pacientes pré e pós 1-ano de imunoterapia ITSL. Foi também realizada análise proteômica por shotgun do extrato comercial de ácaros utilizado nesses pacientes. Os dados da espectrometria de massas foram submetidos a análises para identificação em dois bancos de dados distintos, Astigmata e Swiss-Prot. As proteínas identificadas foram então submetidas à análise utilizando a ferramenta de predição de potencial alergênico AllerCatPro 2.0. Todos os alérgenos foram reconhecidos por pelo menos um isotipo de anticorpo e a diversidade de peptídeos reconhecidos foi maior após 1 ano para ambos os anticorpos. O perfil dinâmico de reconhecimento de epítopos seguiu o mesmo padrão de ligação molecular, com aumento da diversidade após 1 ano de ITSL tanto para IgE quanto para IgG4. Para melhor compreender se a IgG4 que foi produzida durante a imunoterapia tem especificidade similar ao perfil de sensibilização original foram comparados, em uma estrutura secundária e terciária, os padrões de ligação da IgG4 pós imunoterapia aos padrões de ligação IgE basal. Epítopos de IgG4 induzidos pela SLIT foram direcionados contra várias, mas não todas as regiões de ligação de IgE dos alérgenos e reagem também a áreas que não são relevantes para a ligação de IgE, mas podem estar envolvidas no bloqueio alostérico. Quinze epítopos de todas as moléculas, exceto Der p 10, reagiram apenas contra IgG4 e podem ser potenciais alvos para o desenvolvimento de vacinas hipoalergênicas. Na análise por shotgun realizada com o mesmo extrato alergênico usado durante a ITSL, foram identificadas setenta e nove proteínas, dentre elas, dezoito alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus e três de Blomia tropicalis. Identificamos também trinta e um alérgenos de outras dez espécies de ácaros. As outras vinte e sete moléculas identificadas dividem-se em alérgenos de outros artrópodes; insetos, como duas espécies de baratas; fungos; animais; parasitas e plantas. O extrato mostrou-se bastante rico e heterogêneo em número de alérgenos de ácaros, que apesar da diversidade identificada não estão quantificados. Verificamos que o extrato usado para imunoterapia contém muito mais alérgenos do que apenas Der p 1 e Der p 2, os únicos que precisam ser comprovados na mistura. Além disso, chama atenção a presença de alérgenos de outras fontes. Se por um lado a presença de outros alérgenos importantes pode ser útil para dessensibilização de outras moléculas, por outro, a detecção de outros alérgenos que podem ser contaminantes, podem interferir na segurança do tratamento ou até mesmo causar novas sensibilizações. A padronização de extratos alergênicos para imunoterapia é fundamental para garantir um tratamento eficaz e seguro e acompanhar os avanços alcançados no diagnóstico molecular, ademais, alguns epítopos IgG4 identificados podem fornecer ferramentas adicionais para tratamento futuro

Allergen-specific Immunotherapy (AIT) is a safe and effective treatment with longlasting effects. House dust mites (HDM) are midst the main source allergens worldwide and is one of the most applied AIT. Among HDM, Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) and Blomia tropicalis (Blo t) are the main clinically relevant species in tropical countries. Der p 1, 2, 5, 7, 23 and 21 seem to represent the most important allergens. While Der p 10, (tropomyosin) although considered a major allergen in other sources such as shrimp and cockroach, is considered a minor allergen in populations that are not usually exposed to cockroach, differently of what happens in Brazil, where we do not have this epidemiological data. Blomia tropicalis is less extensively studied with Blo t 5 being its major allergen. Epitope dynamic profile along AIT is not well defined. Furthermore, antigenic regions that can elicit IgG but not IgE antibodies are especially interesting as promising targets for vaccine formulations. On the other hand, despite advances made in the field of molecular allergology for allergy diagnosis, there is a great discrepancy in relative to the treatment, since there is a lack of standardization of the extracts regarding quality and quantification of allergens, whose composition remains unknown. Therefore, our objective was to characterize the HDM extract used in sublingual immunotherapy (SLIT) and to evaluate the dynamics of recognition of IgE and IgG4 epitopes as well as to identify epitopes capable of inducing IgG4, but not IgE in allergic individuals. For this, sequences of most relevant allergens and also Der p 10 were included in a 15-mer peptide microarray and tested against pooled sera from 10 patients pre and post 1-year SLIT. A shotgun proteomic analysis of the commercial extract HDM used in these patients was also performed. Mass spectrometry data were analyzed for identification in two different databases, Astigmata and Swiss-Prot. The identified proteins were then subjected to analysis using the AllerCatPro 2.0 allergen potential prediction tool. All allergens were recognized by at least one antibody isotype and the diversity of recognized peptides was higher after 1 year for both antibodies. The dynamic profile of epitope recognition followed the same pattern of molecular binding, with increased diversity after 1 year of SLIT for both IgE and IgG4. To better understand if the IgG4 that was produced during immunotherapy had similar specificity to the original sensitization profile, in a secondary and tertiary strcuture, the IgG4 binding patterns after immunotherapy were compared to the basal IgE binding patterns. SLIT-induced IgG4 epitopes were directed against several, but not all IgE binding regions of the allergens, and also reacted to areas that are not relevant for IgE binding but may be involved in allosteric blocking. Fifteen epitopes of all molecules, except Der p 10, reacted only against IgG4 and could be potential targets for the development of hypoallergenic vaccines. In the shotgun analysis performed with the same allergen extract used during SLIT, seventy-nine proteins were identified, including eighteen allergens from Dermatophagoides pteronyssinus and three from Blomia tropicalis. We also identified thirty-one allergens from ten other mite species. The other twenty-seven molecules identified divide into allergens from other arthropods; insects, such as two species of cockroaches; fungi; animals; parasites and plants. The extract proved to be rich and heterogeneous in terms of number of mite allergens, which, despite the diversity identified, are not quantified. We found that the extract used for immunotherapy contains many more allergens than just Der p 1 and Der p 2, the only ones that need to be proven to be present in the mix. In addition, the presence of allergens from other sources is noteworthy. If, on the one hand, the presence of other important allergens can be useful for the desensitization of other molecules, on the other hand, the detection of other allergens that may be contaminants can interfere with the safety of the treatment or even cause unwanted new sensitization. The standardization of allergen extracts for immunotherapy is essential to ensure an effective and safe treatment and to follow the advances achieved in molecular diagnosis, in addition, some identified IgG4 epitopes may provide additional tools for future treatment