O câncer de pulmão (CP) é um dos tumores malignos mais comuns e uma das principais causas de morte relacionada ao câncer no mundo. O CP é classificado histologicamente em dois grupos: Carcinoma Pulmonar de Pequenas Células (CPPC) e Carcinoma Pulmonar de Células não Pequenas (CPCNP), sendo este o responsável por 85% dos carcinomas primários de pulmão. Um dos principais desafios do CP é o seu diagnóstico tardio, no qual a doença se encontra em estágio avançado impedindo o tratamento curativo. Uma melhor compreensão da patogênese da doença é necessária para auxiliar o diagnóstico, a seleção do melhor tratamento e o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas, a fim de melhorar os resultados do paciente. Com o advento da tecnologia do Sequenciamento de Nova Geração (NGS) uma compreensão abrangente da patogênese molecular da doença foi alcançada e novos biomarcadores emergiram para auxiliar no manejo da doença, oferecendo terapias eficazes e menos tóxicas. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de alteração genética em CPCNP utilizando a técnica de NGS, principalmente, a alteração de genes envolvidos no processo biológico conhecido como Transição Epitélio Mesenquimal (EMT). Os objetivos específicos foram: Traçar o perfil imunológico do CPCNP utilizando a imunofluorescência multiplex e correlacionar os achados com o perfil de alteração genética relacionado à EMT; Investigar a influência de variantes não-codificantes do gene PD-L1 em amostras de CPCNP e correlacionar com expressão proteica e as características clinicopatológicas; Estimar a frequência de mutação no gene EGFR, com destaque para as mutações de significado clínico incerto no CPCNP. A extração de DNA total de 70 amostras de CPCNP foi realizada a partir do kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). A qualidade das amostras foi avaliada utilizando Qubit® 3.0 Fluorometer (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA). O sequenciamento foi realizado através da plataforma de NGS Illumina MiSeq V2 (2x 150, paired-end) e as bibliotecas genômicas foram construídas a partir do TruSeq Custom Amplicon v1.5 kit (TSCAP, Illumina, SanDiego, CA). Variantes genéticas com frequência populacional maior que 1% (popfreq_all >0,01) foram consideradas variantes germinativas e menor que 1% foram classificadas como variantes somáticas. As variantes encontradas foram comparadas com resultados depositados em bancos de dados públicos. Os resultados obtidos para cada objetivo específico foram compilados em três artigos. Artigo 1) Foram encontradas frequências semelhantes de mutações nos genes codificadores de proteínas de checkpoint imunológico e genes relacionados à EMT em nossa coorte e na coorte do TCGA. Os genes mais frequentemente mutados em nossa coorte foram ZEB2 (n = 10; 14%), MMP2 (n = 4; 6%), ZEB1 (n = 2; 3%), CDH1 (n = 2; 3%) e CD44 (n = 2; 3%), todos envolvidos em EMT. Além disso, a variante CTLA4 rs231775 com genótipo AA foi associada a menor sobrevida global (SG), quando comparado ao alelo G (HR = 2,091, IC de 95% = 0,233-2,219, P = 0,05). Artigo 2) As variantes de PD-L1 estudadas não interferiram na expressão da proteína, no entanto, as variantes rs4742098A>G, rs4143815G>C e rs7041009G>A foram associadas à recidiva da doença (P=0,01; P=0,05; P=0,02, respectivamente). No modelo de regressão de Cox, o genótipo GG da variante rs7041009 influenciou a SG (P<0,01), atuando como um fator co-dependente associado à radioterapia e recidiva em pacientes com CPCNP. Artigo 3) A taxa geral de mutação foi de 32,9%, dos quais 20,0% dos casos abrigavam mutações clássicas envolvendo os exons 18-21 do EGFR. Mutações abrangendo outros exons foram identificadas em 12,9% dos casos. 11 variantes foram classificadas como de significado clínico desconhecido. Destas, cinco foram previstas como patogênicas de acordo com análises in silico. Conclui-se que este trabalho contribui na compreensão da patogênese do câncer de pulmão e destaca a importância da utilização do NGS e ferramentas computacionais no manejo clínico de pacientes portadores de CPCNP

Lung cancer (LC) is one of the most common malignant tumors and a leading cause of worldwide cancer-related death. LC is histologically classified into two groups: Small Cell Lung Carcinoma (SCLC) and Non-Small Cell Lung Carcinoma (NSCLC), responsible for 85% of primary lung carcinomas. One of the main challenges of LC is its late diagnosis, in which the disease is in an advanced stage, preventing curative treatment. A better understanding of disease pathogenesis is needed to aid diagnosis, selection of the best medicine, and development of new therapeutic modalities to improve patient outcomes. With the advent of Next Generation Sequencing (NGS) technology, a comprehensive understanding of the molecular pathogenesis of the disease has been achieved, and new biomarkers have emerged to aid in the management of the disease, offering effective and less toxic therapies. The general objective of this work was to evaluate the profile of genetic alteration in NSCLC using the NGS technique, mainly the alteration of genes involved in the biological process known as Epithelium Mesenchymal Transition (EMT). The specific objectives were: To trace the immunological profile of NSCLC using multiplex immunofluorescence and to correlate the findings with the profile of genetic alteration related to EMT; To investigate the influence of non-coding variants of the PD-L1 gene on NSCLC samples and correlate with protein expression and clinicopathological features; To estimate the frequency of mutation in the EGFR gene, with emphasis on mutations of uncertain clinical significance in NSCLC. Total DNA extraction from 70 NSCLC samples was performed using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Sample quality was assessed using Qubit® 3.0 Fluorometer (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA). Sequencing was performed using the Illumina MiSeq V2 NGS platform (2x 150, paired-end), and the genomic libraries were built using the TruSeq Custom Amplicon v1.5 kit (TSCAP, Illumina, SanDiego, CA). Genetic variants with a population frequency greater than 1% (popfreq_all >0.01) were considered germline variants, and less than 1% were classified as somatic variants. The variants found were compared with results deposited in public databases. The results obtained for each specific objective were compiled in three articles. Article 1) Similar frequencies of mutations were found in genes encoding immunological checkpoint proteins and EMT-related genes in our and TCGA cohorts. The most frequently mutated genes in our cohort were ZEB2 (n = 10; 14%), MMP2 (n = 4; 6%), ZEB1 (n = 2; 3%), CDH1 (n = 2; 3%) and CD44 (n = 2; 3%), all involved in TMS. In addition, the CTLA4 rs231775 variant with the AA genotype was associated with lower overall survival (OS) compared to the G allele (HR = 2.091, 95% CI = 0.233-2.219, P = 0.05). Article 2) The PD-L1 variants studied did not interfere with protein expression; however, the rs4742098A>G, rs4143815G>C, and rs7041009G>A variants were associated with disease recurrence (P=0.01; P=0. 05; P=0.02, respectively). In the Cox regression model, the GG genotype of the rs7041009 variant influenced OS (P<0.01), acting as a codependent factor associated with radiotherapy and relapse in NSCLC patients. Article 3) The overall mutation rate was 32.9%, of which 20.0% of the cases harbored classic mutations involving exons 18-21 of the EGFR. Mutations spanning other exons were identified in 12.9% of cases. Eleven variants were classified as of unknown clinical significance. Five were predicted to be pathogenic according to in silico analyses. It is concluded that this work contributes to understanding lung cancer's pathogenesis and highlights the importance of using NGS and computational tools in the clinical management of patients with NSCLC